Diferenciální diagnostika plicních uzlíků identifikovaných pomocí počítačové tomografie (CT) zůstává v klinické praxi výzvou. V této studii charakterizujeme globální metabolom 480 vzorků séra, včetně zdravých kontrol, benigních plicních uzlíků a plicního adenokarcinomu I. stádia. Adenokarcinomy vykazují jedinečné metabolomické profily, zatímco benigní uzlíky a zdraví jedinci mají vysokou podobnost v metabolomických profilech. Ve skupině discovery (n = 306) byla identifikována sada 27 metabolitů pro rozlišení mezi benigními a maligními uzlíky. AUC diskriminačního modelu ve skupině s interní validací (n = 104) a externí validací (n = 111) byla 0,915, respektive 0,945. Analýza metabolických cest odhalila zvýšené glykolytické metabolity spojené se sníženým tryptofanem v séru plicního adenokarcinomu ve srovnání s benigními uzlíky a zdravými kontrolami a naznačila, že příjem tryptofanu podporuje glykolýzu v buňkách rakoviny plic. Naše studie zdůrazňuje hodnotu biomarkerů sérových metabolitů při hodnocení rizika plicních uzlíků detekovaných pomocí CT.
Včasná diagnóza je zásadní pro zlepšení míry přežití u pacientů s rakovinou. Výsledky americké Národní studie screeningu rakoviny plic (NLST) a evropské studie NELSON ukázaly, že screening pomocí nízkodávkové počítačové tomografie (LDCT) může významně snížit úmrtnost na rakovinu plic ve vysoce rizikových skupinách1,2,3. Od širokého používání LDCT pro screening rakoviny plic se výskyt náhodných radiografických nálezů asymptomatických plicních uzlíků neustále zvyšuje4. Plicní uzlíky jsou definovány jako ložiskové opacity o průměru až 3 cm5. Čelíme obtížím při posuzování pravděpodobnosti malignity a při řešení velkého počtu plicních uzlíků náhodně detekovaných na LDCT. Omezení CT mohou vést k častým následným vyšetřením a falešně pozitivním výsledkům, což vede k zbytečným intervencím a nadměrné léčbě6. Proto je třeba vyvinout spolehlivé a užitečné biomarkery pro správnou identifikaci rakoviny plic v raných stádiích a diferenciaci většiny benigních uzlíků při počáteční detekci7.
Komplexní molekulární analýza krve (sérum, plazma, mononukleární buňky periferní krve), včetně genomiky, proteomiky nebo methylace DNA8,9,10, vedla k rostoucímu zájmu o objev diagnostických biomarkerů rakoviny plic. Metabolomické přístupy zároveň měří buněčné konečné produkty, které jsou ovlivněny endogenními a exogenními účinky, a proto se používají k predikci nástupu a výsledku onemocnění. Kapalinová chromatografie-tandemová hmotnostní spektrometrie (LC-MS) je široce používanou metodou pro metabolomické studie díky své vysoké citlivosti a velkému dynamickému rozsahu, který může zahrnovat metabolity s různými fyzikálně-chemickými vlastnostmi11,12,13. Ačkoli se globální metabolomická analýza plazmy/séra používá k identifikaci biomarkerů spojených s diagnózou rakoviny plic14,15,16,17 a účinností léčby,18 klasifikátory sérových metabolitů pro rozlišení mezi benigními a maligními plicními uzlíky je stále třeba hodně studovat. - rozsáhlý výzkum.
Adenokarcinom a dlaždicobuněčný karcinom jsou dva hlavní podtypy nemalobuněčného karcinomu plic (NSCLC). Různé CT screeningové testy ukazují, že adenokarcinom je nejčastějším histologickým typem rakoviny plic1,19,20,21. V této studii jsme použili ultravýkonnou kapalinovou chromatografii s hmotnostní spektrometrií s vysokým rozlišením (UPLC-HRMS) k provedení metabolomické analýzy celkem 695 vzorků séra, včetně zdravých kontrol, benigních plicních uzlíků a vzorků detekovaných na CT o velikosti ≤3 cm. Screening plicního adenokarcinomu stádia I. Identifikovali jsme panel sérových metabolitů, které odlišují plicní adenokarcinom od benigních uzlíků a zdravých kontrol. Analýza obohacení metabolické dráhy ukázala, že abnormální metabolismus tryptofanu a glukózy jsou častými změnami u plicního adenokarcinomu ve srovnání s benigními uzlíky a zdravými kontrolami. Nakonec jsme vytvořili a validovali klasifikátor sérového metabolismu s vysokou specificitou a citlivostí pro rozlišení mezi maligními a benigními plicními uzlíky detekovanými pomocí LDCT, což může pomoci při včasné diferenciální diagnostice a posouzení rizika.
V této studii byly retrospektivně odebrány vzorky séra odpovídající pohlaví a věku od 174 zdravých kontrolních osob, 292 pacientů s benigními plicními uzlíky a 229 pacientů s plicním adenokarcinomem stadia I. Demografické charakteristiky 695 subjektů jsou uvedeny v doplňkové tabulce 1.
Jak je znázorněno na obrázku 1a, v Onkologickém centru Sun Yat-senovy univerzity bylo odebráno celkem 480 vzorků séra, včetně 174 vzorků od zdravých kontrolních jedinců (HC), 170 benigních uzlíků (BN) a 136 vzorků plicního adenokarcinomu (LA) ve stádiu I. Byla provedena discovery kohorta pro necílené metabolomické profilování pomocí ultravýkonné kapalinové chromatografie s hmotnostní spektrometrií s vysokým rozlišením (UPLC-HRMS). Jak je znázorněno na doplňkovém obrázku 1, byly identifikovány diferenciální metabolity mezi LA a HC, LA a BN za účelem vytvoření klasifikačního modelu a dalšího prozkoumání analýzy diferenciálních metabolitových drah. Interní, respektive externí validaci bylo podrobeno 104 vzorků odebraných Onkologickým centrem Sun Yat-senovy univerzity a 111 vzorků odebraných dvěma dalšími nemocnicemi.
a Studijní populace v objevné kohortě, která podstoupila globální metabolomickou analýzu séra pomocí ultravýkonné kapalinové chromatografie s hmotnostní spektrometrií s vysokým rozlišením (UPLC-HRMS). b Diskriminační analýza metodou parciálních nejmenších čtverců (PLS-DA) celkového metabolomu 480 vzorků séra ze studijní kohorty, včetně zdravých kontrol (HC, n = 174), benigních uzlíků (BN, n = 170) a plicního adenokarcinomu stadia I (Los Angeles, n = 136). +ESI, režim pozitivní elektrosprejové ionizace, -ESI, režim negativní elektrosprejové ionizace. c–e Metabolity s významně odlišným zastoupením ve dvou daných skupinách (oboustranný Wilcoxonův test znaménkových pořadů, p-hodnota upravená podle míry falešných objevů, FDR <0,05) jsou zobrazeny červeně (násobná změna > 1,2) a modře (násobná změna < 0,83). ) zobrazené na grafu sopky. f Hierarchická tepelná mapa shlukování zobrazující významné rozdíly v počtu anotovaných metabolitů mezi LA a BN. Zdrojová data jsou poskytována ve formě zdrojových datových souborů.
Celkový sérový metabolom 174 HC, 170 BN a 136 LA ve skupině discovery byl analyzován pomocí UPLC-HRMS analýzy. Nejprve ukazujeme, že vzorky kontroly kvality (QC) se těsně shlukují ve středu modelu nekontrolované analýzy hlavních komponent (PCA), což potvrzuje stabilitu výkonnosti aktuální studie (doplňkový obrázek 2).
Jak je znázorněno v analýze parciálních nejmenších čtverců (PLS-DA) na obrázku 1b, zjistili jsme, že mezi LA a BN, LA a HC existují jasné rozdíly v režimech pozitivní (+ESI) a negativní (−ESI) elektrosprejové ionizace. Mezi BN a HC však nebyly zjištěny žádné významné rozdíly v podmínkách +ESI a -ESI.
Mezi LA a HC jsme nalezli 382 diferenciálních znaků, 231 diferenciálních znaků mezi LA a BN a 95 diferenciálních znaků mezi BN a HC (Wilcoxonův test znaménkových pořadů, FDR <0,05 a vícenásobná změna >1,2 nebo <0,83) (obrázek 1c-e). Vrcholy byly dále anotovány (doplňková data 3) oproti databázi (knihovna mzCloud/HMDB/Chemspider) pomocí hodnoty m/z, retenčního času a vyhledávání hmotnostního spektra fragmentace (podrobnosti popsány v části Metody)22. Nakonec bylo identifikováno 33 a 38 anotovaných metabolitů s významnými rozdíly v hojnosti pro LA versus BN (obrázek 1f a doplňková tabulka 2) a LA versus HC (doplňkový obrázek 3 a doplňková tabulka 2). Naproti tomu v BN a HC byly identifikovány pouze 3 metabolity s významnými rozdíly v hojnosti (doplňková tabulka 2), což je v souladu s překrýváním mezi BN a HC v PLS-DA. Tyto diferenciální metabolity pokrývají širokou škálu biochemických látek (doplňkový obrázek 4). Celkově vzato tyto výsledky ukazují významné změny v sérovém metabolomu, které odrážejí maligní transformaci rakoviny plic v raném stádiu ve srovnání s benigními plicními uzlíky nebo zdravými jedinci. Podobnost sérového metabolomu BN a HC naznačuje, že benigní plicní uzlíky mohou sdílet mnoho biologických charakteristik se zdravými jedinci. Vzhledem k tomu, že mutace genu receptoru epidermálního růstového faktoru (EGFR) jsou běžné u plicního adenokarcinomu subtypu 23, snažili jsme se určit dopad řídicích mutací na sérový metabolom. Poté jsme analyzovali celkový metabolomický profil 72 případů se statusem EGFR ve skupině plicního adenokarcinomu. Je zajímavé, že jsme v analýze PCA zjistili srovnatelné profily mezi pacienty s mutací EGFR (n = 41) a pacienty s divokým typem EGFR (n = 31) (doplňkový obrázek 5a). Identifikovali jsme však 7 metabolitů, jejichž množství bylo u pacientů s mutací EGFR významně změněno ve srovnání s pacienty s divokým typem EGFR (t-test, p < 0,05 a násobek změny > 1,2 nebo < 0,83) (doplňkový obrázek 5b). Většina těchto metabolitů (5 ze 7) jsou acylkarnitiny, které hrají důležitou roli v drahách oxidace mastných kyselin.
Jak je znázorněno v pracovním postupu na obrázku 2a, biomarkery pro klasifikaci uzlíků byly získány pomocí operátorů nejmenšího absolutního zmenšení a výběru založeného na 33 diferenciálních metabolitech identifikovaných v LA (n = 136) a BN (n = 170). Nejlepší kombinace proměnných (LASSO) – binární logistický regresní model. Pro testování spolehlivosti modelu byla použita desetinásobná křížová validace. Výběr proměnných a regularizace parametrů jsou upraveny penalizací za maximalizaci pravděpodobnosti s parametrem λ24. Globální metabolomická analýza byla dále provedena nezávisle ve skupinách interní validace (n = 104) a externí validace (n = 111) za účelem testování klasifikační výkonnosti diskriminačního modelu. Výsledkem bylo, že 27 metabolitů v objevovací sadě bylo identifikováno jako nejlepší diskriminační model s největší průměrnou hodnotou AUC (obr. 2b), z nichž 9 mělo zvýšenou aktivitu a 18 sníženou aktivitu v LA ve srovnání s BN (obr. 2c).
Pracovní postup pro vytvoření klasifikátoru plicních uzlíků, včetně výběru nejlepšího panelu sérových metabolitů v sadě pro objevování pomocí binárního logistického regresního modelu prostřednictvím desetinásobné křížové validace a vyhodnocení prediktivní výkonnosti v sadách pro interní a externí validaci. b Statistiky křížové validace regresního modelu LASSO pro výběr metabolických biomarkerů. Výše uvedená čísla představují průměrný počet biomarkerů vybraných při daném λ. Červená tečkovaná čára představuje průměrnou hodnotu AUC při odpovídající lambda. Šedé chybové úsečky představují minimální a maximální hodnoty AUC. Tečkovaná čára označuje nejlepší model s 27 vybranými biomarkery. AUC, plocha pod křivkou ROC (Receiver Operating Characteristic). c Násobek změn 27 vybraných metabolitů ve skupině LA ve srovnání se skupinou BN ve skupině pro objevování. Červený sloupec – aktivace. Modrý sloupec představuje pokles. d–f Křivky ROC (Receiver Operating Characteristic) znázorňující sílu diskriminačního modelu na základě 27 kombinací metabolitů v sadách pro objevování, interní a externí validaci. Zdrojová data jsou poskytována ve formě zdrojových datových souborů.
Na základě vážených regresních koeficientů těchto 27 metabolitů byl vytvořen predikční model (doplňková tabulka 3). ROC analýza založená na těchto 27 metabolitech poskytla hodnotu plochy pod křivkou (AUC) 0,933, citlivost objevovací skupiny byla 0,868 a specificita 0,859 (obr. 2d). Mezi 38 anotovanými diferenciálními metabolity mezi LA a HC dosáhla sada 16 metabolitů AUC 0,902 s citlivostí 0,801 a specificitou 0,856 při rozlišení LA od HC (doplňkový obrázek 6a-c). Byly také porovnány hodnoty AUC založené na různých prahových hodnotách násobné změny pro diferenciální metabolity. Zjistili jsme, že klasifikační model fungoval nejlépe při rozlišení mezi LA a BN (HC), když byla úroveň násobné změny nastavena na 1,2 oproti 1,5 nebo 2,0 (doplňkový obrázek 7a,b). Klasifikační model založený na 27 skupinách metabolitů byl dále validován v interních a externích kohortách. Hodnota AUC pro interní validaci byla 0,915 (senzitivita 0,867, specificita 0,811) a pro externí validaci 0,945 (senzitivita 0,810, specificita 0,979) (obr. 2e, f). Pro posouzení mezilaboratorní efektivity bylo 40 vzorků z externí kohorty analyzováno v externí laboratoři, jak je popsáno v části Metody. Přesnost klasifikace dosáhla AUC 0,925 (doplňkový obrázek 8). Vzhledem k tomu, že dlaždicobuněčný karcinom plic (LUSC) je druhým nejčastějším podtypem nemalobuněčného karcinomu plic (NSCLC) po plicním adenokarcinomu (LUAD), testovali jsme také validovaný potenciální užitečnost metabolických profilů. BN a 16 případů LUSC. AUC pro rozlišení mezi LUSC a BN byla 0,776 (doplňkový obrázek 9), což naznačuje horší schopnost ve srovnání s rozlišením mezi LUAD a BN.
Studie ukázaly, že velikost uzlíků na CT snímcích pozitivně koreluje s pravděpodobností malignity a zůstává hlavním determinantem léčby uzlíků25,26,27. Analýza dat z velké kohorty screeningové studie NELSON ukázala, že riziko malignity u subjektů s uzlinami <5 mm bylo dokonce podobné jako u subjektů bez uzlin28. Minimální velikost vyžadující pravidelné CT monitorování je proto 5 mm, jak doporučuje Britská hrudní společnost (BTS), a 6 mm, jak doporučuje Fleischnerova společnost29. Uzlíky větší než 6 mm a bez zjevných benigních rysů, nazývané neurčité plicní uzlíky (IPN), však zůstávají v klinické praxi velkou výzvou v hodnocení a léčbě30,31. Dále jsme zkoumali, zda velikost uzlíku ovlivňuje metabolomické signatury, s využitím sdružených vzorků z discovery a interní validační kohort. Zaměřili jsme se na 27 validovaných biomarkerů a nejprve jsme porovnali PCA profily metabolomů HC a BN sub-6 mm. Zjistili jsme, že většina datových bodů pro HC a BN se překrývala, což ukazuje, že hladiny metabolitů v séru byly v obou skupinách podobné (obr. 3a). Mapy znaků napříč různými velikostními rozsahy zůstaly u BN a LA zachovány (obr. 3b, c), zatímco mezi maligními a benigními uzlíky v rozsahu 6–20 mm bylo pozorováno oddělení (obr. 3d). Tato kohorta měla AUC 0,927, specificitu 0,868 a senzitivitu 0,820 pro predikci malignity uzlíků o velikosti 6 až 20 mm (obr. 3e, f). Naše výsledky ukazují, že klasifikátor dokáže zachytit metabolické změny způsobené časnou maligní transformací bez ohledu na velikost uzlíku.
ad Porovnání profilů PCA mezi specifikovanými skupinami na základě metabolického klasifikátoru 27 metabolitů. CC a BN < 6 mm. b BN < 6 mm vs BN 6–20 mm. v LA 6–20 mm vs LA 20–30 mm. g BN 6–20 mm a LA 6–20 mm. GC, n = 174; BN < 6 mm, n = 153; BN 6–20 mm, n = 91; LA 6–20 mm, n = 89; LA 20–30 mm, n = 77. e Křivka ROC (Receiver Operating Characteristic) znázorňující výkon diskriminačního modelu pro uzlíky o velikosti 6–20 mm. f Hodnoty pravděpodobnosti byly vypočteny na základě logistického regresního modelu pro uzlíky o velikosti 6–20 mm. Šedá tečkovaná čára představuje optimální mezní hodnotu (0,455). Výše uvedená čísla představují procento případů předpokládaných pro Los Angeles. Použijte oboustranný Studentův t-test. PCA, analýza hlavních komponent. Plocha pod křivkou AUC. Zdrojová data jsou poskytována ve formě zdrojových datových souborů.
Pro ilustraci výkonnosti navrhovaného modelu predikce malignity byly dále vybrány čtyři vzorky (ve věku 44–61 let) s podobnou velikostí plicních uzlíků (7–9 mm) (obr. 4a, b). Při počátečním screeningu se případ 1 projevil jako solidní uzlík s kalcifikací, což je znak spojený s benigní příčinou, zatímco případ 2 se projevil jako neurčitý částečně solidní uzlík bez zjevných benigních znaků. Tři kola následných CT vyšetření ukázala, že tyto případy zůstaly stabilní po dobu 4 let, a proto byly považovány za benigní uzlíky (obr. 4a). Ve srovnání s klinickým hodnocením sériových CT vyšetření jednorázová analýza metabolitů v séru se současným klasifikačním modelem rychle a správně identifikovala tyto benigní uzlíky na základě pravděpodobnostních omezení (tabulka 1). Obrázek 4b v případě 3 ukazuje uzlík se známkami pleurální retrakce, která je nejčastěji spojena s malignitou32. Případ 4 se projevil jako neurčitý částečně solidní uzlík bez důkazu benigní příčiny. Všechny tyto případy byly podle klasifikačního modelu predikovány jako maligní (tabulka 1). Posouzení plicního adenokarcinomu bylo prokázáno histopatologickým vyšetřením po resekci plic (obr. 4b). U externí validační sady metabolický klasifikátor přesně předpověděl dva případy neurčitých plicních uzlíků větších než 6 mm (doplňkový obrázek 10).
CT snímky axiálního okna plic u dvou případů benigních uzlíků. V případě 1 CT vyšetření po 4 letech ukázalo stabilní solidní uzlík o rozměrech 7 mm s kalcifikací v pravém dolním laloku. V případě 2 CT vyšetření po 5 letech odhalilo stabilní, částečně solidní uzlík o průměru 7 mm v pravém horním laloku. b CT snímky plic v axiálním oknu a odpovídající patologické studie dvou případů adenokarcinomu stadia I před resekcí plic. Případ 3 odhalil uzlík o průměru 8 mm v pravém horním laloku s pleurální retrakcí. Případ 4 odhalil částečně solidní uzlík ve tvaru matného skla o rozměrech 9 mm v levém horním laloku. Barvení resekované plicní tkáně hematoxylinem a eosinem (H&E) (měřítko = 50 μm) demonstrující acinární růstový vzorec plicního adenokarcinomu. Šipky označují uzlíky detekované na CT snímcích. H&E snímky jsou reprezentativní obrazy více (>3) mikroskopických polí vyšetřených patologem.
Naše výsledky dohromady ukazují potenciální hodnotu biomarkerů sérových metabolitů v diferenciální diagnostice plicních uzlíků, což může představovat výzvu při hodnocení CT screeningu.
Na základě validovaného panelu diferenciálních metabolitů jsme se snažili identifikovat biologické koreláty hlavních metabolických změn. Analýza obohacení metabolických drah KEGG pomocí softwaru MetaboAnalyst identifikovala 6 společných významně změněných metabolických drah mezi oběma danými skupinami (LA vs. HC a LA vs. BN, adjustované p ≤ 0,001, účinek > 0,01). Tyto změny byly charakterizovány poruchami metabolismu pyruvátu, metabolismu tryptofanu, metabolismu niacinu a nikotinamidu, glykolýzy, cyklu TCA a metabolismu purinů (obr. 5a). Poté jsme provedli cílenou metabolomiku k ověření hlavních změn pomocí absolutní kvantifikace. Stanovení běžných metabolitů v běžně změněných drahách pomocí trojité kvadrupólové hmotnostní spektrometrie (QQQ) za použití autentických standardů metabolitů. Demografické charakteristiky cílového vzorku metabolomické studie jsou uvedeny v doplňkové tabulce 4. V souladu s našimi globálními metabolomickými výsledky kvantitativní analýza potvrdila, že hypoxanthin a xanthin, pyruvát a laktát byly ve srovnání s BN a HC zvýšené (obr. 5b, c, p <0,05). Mezi BN a HC však nebyly zjištěny žádné významné rozdíly v těchto metabolitech.
Analýza obohacení signální dráhy KEGG u významně odlišných metabolitů ve skupině LA ve srovnání se skupinami BN a HC. Byl použit oboustranný Globaltest a hodnoty p byly upraveny pomocí Holm-Bonferroniho metody (upravené p ≤ 0,001 a velikost účinku > 0,01). b–d Houslové grafy znázorňující hladiny hypoxanthinu, xanthinu, laktátu, pyruvátu a tryptofanu v sérových HC, BN a LA stanovené pomocí LC-MS/MS (n = 70 na skupinu). Bílé a černé tečkované čáry označují medián a kvartil. e Houslový graf znázorňující normalizovanou expresi mRNA SLC7A5 a QPRT Log2TPM (transkripty na milion) v plicním adenokarcinomu (n = 513) ve srovnání s normální plicní tkání (n = 59) v datovém souboru LUAD-TCGA. Bílý rámeček představuje interkvartilní rozmezí, vodorovná černá čára uprostřed představuje medián a svislá černá čára vycházející z rámečku představuje 95% interval spolehlivosti (CI). f Pearsonův korelační graf exprese SLC7A5 a GAPDH v plicním adenokarcinomu (n = 513) a normální plicní tkáni (n = 59) v datovém souboru TCGA. Šedá oblast představuje 95% CI. r, Pearsonův korelační koeficient. g Normalizované buněčné hladiny tryptofanu v buňkách A549 transfekovaných nespecifickou kontrolní shRNA (NC) a shSLC7A5 (Sh1, Sh2) stanovené pomocí LC-MS/MS. Je prezentována statistická analýza pěti biologicky nezávislých vzorků v každé skupině. h Buněčné hladiny NADt (celkový NAD, včetně NAD+ a NADH) v buňkách A549 (NC) a buňkách A549 s knockdownem SLC7A5 (Sh1, Sh2). Je prezentována statistická analýza tří biologicky nezávislých vzorků v každé skupině. i Glykolytická aktivita buněk A549 před a po snížení exprese SLC7A5 byla měřena pomocí extracelulární rychlosti acidifikace (ECAR) (n = 4 biologicky nezávislé vzorky na skupinu). 2-DG,2-deoxy-D-glukóza. V (b–h) byl použit dvoustranný Studentův t-test. V (g–i) chybové úsečky představují průměr ± SD, každý experiment byl proveden třikrát nezávisle a výsledky byly podobné. Zdrojová data jsou poskytnuta ve formě zdrojových datových souborů.
Vzhledem k významnému dopadu změněného metabolismu tryptofanu ve skupině LA jsme také pomocí QQQ stanovili hladiny tryptofanu v séru ve skupinách HC, BN a LA. Zjistili jsme, že sérový tryptofan byl ve srovnání s HC nebo BN snížen (p < 0,001, obrázek 5d), což je v souladu s předchozími zjištěními, že hladiny tryptofanu v oběhu jsou nižší u pacientů s rakovinou plic než u zdravých kontrol z kontrolní skupiny33,34,35. Jiná studie s použitím PET/CT indikátoru 11C-methyl-L-tryptofanu zjistila, že doba retence signálu tryptofanu v tkáni rakoviny plic byla významně zvýšena ve srovnání s benigními lézemi nebo normální tkání36. Předpokládáme, že pokles tryptofanu v séru LA může odrážet aktivní vychytávání tryptofanu buňkami rakoviny plic.
Je také známo, že konečným produktem kynureninové dráhy katabolismu tryptofanu je NAD+37,38, což je důležitý substrát pro reakci glyceraldehyd-3-fosfátu s 1,3-bisfosfoglycerátem v glykolýze39. Zatímco předchozí studie se zaměřovaly na roli katabolismu tryptofanu v imunitní regulaci, my jsme se v této studii snažili objasnit souhru mezi dysregulací tryptofanu a glykolytickými dráhami pozorovanými. Je známo, že člen 5 rodiny transportérů rozpuštěných látek 7 (SLC7A5) je tryptofanový transportér43,44,45. Chinolinová kyselina fosforibosyltransferáza (QPRT) je enzym nacházející se za kynureninovou dráhou, který přeměňuje kyselinu chinolinovou na NAMN46. Inspekce datového souboru LUAD TCGA ukázala, že jak SLC7A5, tak QPRT byly v nádorové tkáni významně zvýšeně regulovány ve srovnání s normální tkání (obr. 5e). Toto zvýšení bylo pozorováno ve stádiích I a II, stejně jako ve stádiích III a IV plicního adenokarcinomu (doplňkový obrázek 11), což naznačuje časné poruchy metabolismu tryptofanu spojené s tumorigenezí.
Soubor dat LUAD-TCGA navíc ukázal pozitivní korelaci mezi expresí mRNA SLC7A5 a GAPDH ve vzorcích pacientů s rakovinou (r = 0,45, p = 1,55E-26, obrázek 5f). Naproti tomu nebyla zjištěna žádná významná korelace mezi těmito genovými signaturami v normální plicní tkáni (r = 0,25, p = 0,06, obrázek 5f). Utlumení exprese SLC7A5 (doplňkový obrázek 12) v buňkách A549 významně snížilo buněčné hladiny tryptofanu a NAD(H) (obrázek 5g,h), což vedlo k oslabení glykolytické aktivity měřené extracelulární rychlostí acidifikace (ECAR) (obrázek 1). 5i). Na základě metabolických změn v séru a detekce in vitro tedy předpokládáme, že metabolismus tryptofanu může produkovat NAD+ prostřednictvím kynureninové dráhy a hrát důležitou roli v podpoře glykolýzy u rakoviny plic.
Studie ukázaly, že velký počet neurčitých plicních uzlíků detekovaných pomocí LDCT může vést k nutnosti dalšího vyšetření, jako je PET-CT, plicní biopsie a nadměrná léčba z důvodu falešně pozitivní diagnózy malignity.31 Jak je znázorněno na obrázku 6, naše studie identifikovala panel sérových metabolitů s potenciální diagnostickou hodnotou, které mohou zlepšit stratifikaci rizika a následnou léčbu plicních uzlíků detekovaných pomocí CT.
Plicní uzlíky se vyšetřují pomocí nízkodávkové výpočetní tomografie (LDCT) se zobrazovacími znaky naznačujícími benigní nebo maligní příčiny. Nejistý výsledek léčby uzlíků může vést k častým následným návštěvám, zbytečným intervencím a nadměrné léčbě. Zahrnutí sérových metabolických klasifikátorů s diagnostickou hodnotou může zlepšit posouzení rizika a následnou léčbu plicních uzlíků. PET pozitronová emisní tomografie.
Data z americké studie NLST a evropské studie NELSON naznačují, že screening vysoce rizikových skupin pomocí nízkodávkové počítačové tomografie (LDCT) může snížit úmrtnost na rakovinu plic1,3. Nejnáročnější však zůstává posouzení rizika a následná klinická léčba velkého počtu náhodně detekovaných plicních uzlíků pomocí LDCT. Hlavním cílem je optimalizovat správnou klasifikaci stávajících protokolů založených na LDCT začleněním spolehlivých biomarkerů.
Určité molekulární biomarkery, jako například krevní metabolity, byly identifikovány porovnáním rakoviny plic se zdravými kontrolami15,17. V této studii jsme se zaměřili na aplikaci analýzy metabolomiky séra k rozlišení mezi benigními a maligními plicními uzlíky náhodně detekovanými pomocí LDCT. Porovnali jsme globální metabolom séra vzorků zdravé kontroly (HC), benigních plicních uzlíků (BN) a vzorků plicního adenokarcinomu (LA) I. stádia pomocí analýzy UPLC-HRMS. Zjistili jsme, že HC a BN měly podobné metabolické profily, zatímco LA vykazovala významné změny ve srovnání s HC a BN. Identifikovali jsme dvě sady sérových metabolitů, které odlišují LA od HC a BN.
Současný systém identifikace benigních a maligních uzlíků založený na LDCT je založen především na velikosti, hustotě, morfologii a rychlosti růstu uzlíků v čase30. Předchozí studie ukázaly, že velikost uzlíků úzce souvisí s pravděpodobností rakoviny plic. I u vysoce rizikových pacientů je riziko malignity u uzlin <6 mm <1 %. Riziko malignity u uzlin o velikosti 6 až 20 mm se pohybuje od 8 % do 64 %30. Fleischnerova společnost proto doporučuje pro rutinní CT sledování hraniční průměr 6 mm.29 Hodnocení rizika a léčba neurčitých plicních uzlíků (IPN) větších než 6 mm však nebyly dosud dostatečně provedeny31. Současná léčba vrozených srdečních vad je obvykle založena na bdělém vyčkávání s častým CT monitorováním.
Na základě validovaného metabolomu jsme poprvé prokázali překrývání metabolomických signatur mezi zdravými jedinci a benigními uzlíky <6 mm. Biologická podobnost je v souladu s předchozími zjištěními CT, že riziko malignity u uzlíků <6 mm je stejně nízké jako u subjektů bez uzlin.30 Je třeba poznamenat, že naše výsledky také ukazují, že benigní uzlíky <6 mm a ≥6 mm mají vysokou podobnost v metabolomických profilech, což naznačuje, že funkční definice benigní etiologie je konzistentní bez ohledu na velikost uzlíku. Moderní diagnostické panely sérových metabolitů tak mohou poskytnout jediný test jako vylučovací test, když jsou uzlíky poprvé detekovány na CT, a potenciálně snížit sériové monitorování. Zároveň stejný panel metabolických biomarkerů rozlišoval maligní uzlíky o velikosti ≥6 mm od benigních uzlíků a poskytoval přesné predikce pro IPN podobné velikosti a nejednoznačných morfologických znaků na CT snímcích. Tento klasifikátor sérového metabolismu si vedl dobře při predikci malignity uzlíků ≥6 mm s AUC 0,927. Naše výsledky dohromady naznačují, že unikátní metabolomické signatury v séru mohou specificky odrážet časné metabolické změny vyvolané nádorem a mají potenciální hodnotu jako prediktory rizika, nezávisle na velikosti uzlíku.
Zejména plicní adenokarcinom (LUAD) a dlaždicobuněčný karcinom (LUSC) jsou hlavními typy nemalobuněčného karcinomu plic (NSCLC). Vzhledem k tomu, že LUSC je silně spojen s užíváním tabáku47 a LUAD je nejčastější histologií náhodně zjištěných plicních uzlíků při CT screeningu48, byl náš klasifikační model speciálně vytvořen pro vzorky adenokarcinomu ve stádiu I. Wang a kolegové se také zaměřili na LUAD a identifikovali devět lipidových signatur pomocí lipidomiky k rozlišení rakoviny plic v raném stádiu od zdravých jedinců17. Testovali jsme současný klasifikační model na 16 případech LUSC ve stádiu I a 74 benigních uzlících a pozorovali jsme nízkou přesnost predikce LUSC (AUC 0,776), což naznačuje, že LUAD a LUSC mohou mít své vlastní metabolomické signatury. Ukázalo se, že LUAD a LUSC se liší v etiologii, biologickém původu a genetických aberacích49. Proto by do trénovacích modelů pro populační detekci rakoviny plic ve screeningových programech měly být zahrnuty i jiné typy histologie.
Zde jsme identifikovali šest nejčastěji pozměněných metabolických drah u plicního adenokarcinomu ve srovnání se zdravými kontrolami a benigními uzlíky. Xanthin a hypoxanthin jsou běžné metabolity purinové metabolické dráhy. V souladu s našimi výsledky byly meziprodukty spojené s metabolismem purinů v séru nebo tkáních pacientů s plicním adenokarcinomem významně zvýšené ve srovnání se zdravými kontrolami nebo pacienty v preinvazivním stádiu15,50. Zvýšené hladiny xanthinu a hypoxanthinu v séru mohou odrážet anabolismus vyžadovaný rychle proliferujícími rakovinnými buňkami. Dysregulace metabolismu glukózy je dobře známým znakem metabolismu rakoviny51. Zde jsme pozorovali významný nárůst pyruvátu a laktátu ve skupině LA ve srovnání se skupinou HC a BN, což je v souladu s předchozími zprávami o abnormalitách glykolytických drah v profilech sérového metabolomu u pacientů s nemalobuněčným karcinomem plic (NSCLC) a zdravých kontrol. Výsledky jsou konzistentní52,53.
Důležité je, že jsme pozorovali inverzní korelaci mezi metabolismem pyruvátu a tryptofanu v séru plicních adenokarcinomů. Hladiny tryptofanu v séru byly ve skupině LA sníženy ve srovnání se skupinou HC nebo BN. Je zajímavé, že předchozí rozsáhlá studie s použitím prospektivní kohorty zjistila, že nízké hladiny cirkulujícího tryptofanu byly spojeny se zvýšeným rizikem rakoviny plic 54. Tryptofan je esenciální aminokyselina, kterou získáváme výhradně z potravy. Došli jsme k závěru, že deplece tryptofanu v séru u plicního adenokarcinomu může odrážet rychlé vyčerpání tohoto metabolitu. Je dobře známo, že konečný produkt katabolismu tryptofanu prostřednictvím kynureninové dráhy je zdrojem de novo syntézy NAD+. Protože NAD+ je produkován primárně cestou záchrany, význam NAD+ v metabolismu tryptofanu ve zdraví a nemoci je třeba dosud určit46. Naše analýza databáze TCGA ukázala, že exprese tryptofanového transportéru solutů 7A5 (SLC7A5) byla u plicního adenokarcinomu významně zvýšena ve srovnání s normálními kontrolami a pozitivně korelovala s expresí glykolytického enzymu GAPDH. Předchozí studie se zaměřovaly především na roli katabolismu tryptofanu v potlačení protinádorové imunitní odpovědi40,41,42. Zde demonstrujeme, že inhibice vychytávání tryptofanu snížením exprese SLC7A5 v buňkách rakoviny plic vede k následnému snížení buněčných hladin NAD a souvisejícímu útlumu glykolytické aktivity. Stručně řečeno, naše studie poskytuje biologický základ pro změny v sérovém metabolismu spojené s maligní transformací plicního adenokarcinomu.
Mutace EGFR jsou nejčastějšími řídicími mutacemi u pacientů s NSCLC. V naší studii jsme zjistili, že pacienti s mutací EGFR (n = 41) měli celkové metabolomické profily podobné pacientům s divokým typem EGFR (n = 31), ačkoli jsme u některých pacientů s acylkarnitinem zjistili snížené sérové hladiny. Zjištěnou funkcí acylkarnitinů je transport acylových skupin z cytoplazmy do mitochondriální matrix, což vede k oxidaci mastných kyselin za vzniku energie 55. V souladu s našimi zjištěními nedávná studie také identifikovala podobné profily metabolomu mezi nádory s mutací EGFR a divokým typem EGFR analýzou globálního metabolomu 102 vzorků tkáně plicního adenokarcinomu 50. Je zajímavé, že obsah acylkarnitinu byl nalezen také ve skupině s mutací EGFR. Proto by si zasloužilo další studium, zda změny v hladinách acylkarnitinu odrážejí metabolické změny vyvolané EGFR a základní molekulární dráhy.
Závěrem lze říci, že naše studie zavádí klasifikátor sérového metabolismu pro diferenciální diagnostiku plicních uzlíků a navrhuje pracovní postup, který může optimalizovat posouzení rizik a usnadnit klinickou léčbu na základě CT vyšetření.
Tato studie byla schválena etickou komisí Onkologické nemocnice Univerzity Sun Yat-sena, První přidruženou nemocnicí Univerzity Sun Yat-sena a Etickou komisí Onkologické nemocnice Univerzity v Čeng-čou. V discovery a interní validační skupině bylo odebráno 174 sér od zdravých jedinců a 244 sér z benigních uzlíků od jedinců podstupujících každoroční lékařské prohlídky na Oddělení kontroly a prevence rakoviny Onkologického centra Univerzity Sun Yat-sena a 166 benigních uzlíků. Adenokarcinomy plic stádia I byly odebrány z Onkologického centra Univerzity Sun Yat-sena. V externí validační kohortě bylo 48 případů benigních uzlíků, 39 případů adenokarcinomu plic stádia I z První přidružené nemocnice Univerzity Sun Yat-sena a 24 případů adenokarcinomu plic stádia I z Onkologické nemocnice v Čeng-čou. Onkologické centrum Univerzity Sun Yat-sena také odebralo 16 případů dlaždicobuněčného karcinomu plic stádia I, aby otestovalo diagnostickou schopnost zavedeného metabolického klasifikátoru (charakteristiky pacientů jsou uvedeny v doplňkové tabulce 5). Vzorky z objevovací kohorty a interní validační kohorty byly odebrány mezi lednem 2018 a květnem 2020. Vzorky pro externí validační kohortu byly odebrány mezi srpnem 2021 a říjnem 2022. Aby se minimalizovalo genderové zkreslení, byl do každé kohorty zařazen přibližně stejný počet mužských a ženských případů. Tým pro objevování a tým pro interní hodnocení. Pohlaví účastníků bylo určeno na základě vlastního hlášení. Od všech účastníků byl získán informovaný souhlas a nebyla poskytnuta žádná kompenzace. Subjekty s benigními uzlinami byly ty, které měly v době analýzy stabilní skóre CT vyšetření po 2 až 5 letech, s výjimkou 1 případu z externího validačního vzorku, který byl odebrán před operací a diagnostikován histopatologicky. S výjimkou chronické bronchitidy. Případy plicního adenokarcinomu byly odebrány před resekcí plic a potvrzeny patologickou diagnózou. Vzorky krve nalačno byly odebrány do zkumavek pro separaci séra bez použití antikoagulancií. Vzorky krve byly sráženy po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě a poté centrifugovány při 2851 × g po dobu 10 minut při 4 °C za účelem odběru supernatantu séra. Alikvotní podíly séra byly zmrazeny při teplotě -80 °C do extrakce metabolitů. Oddělení prevence rakoviny a lékařského vyšetření Onkologického centra Univerzity Sun Yat-sena odebralo směs sér od 100 zdravých dárců, včetně stejného počtu mužů a žen ve věku 40 až 55 let. Stejné objemy vzorku od každého dárce byly smíchány, výsledná směs byla rozdělena na alikvotní podíly a uložena při teplotě -80 °C. Směs sér byla použita jako referenční materiál pro kontrolu kvality a standardizaci dat.
Referenční sérum a testované vzorky byly rozmrazeny a metabolity byly extrahovány kombinovanou extrakční metodou (MTBE/methanol/voda) 56. Stručně řečeno, 50 μl séra bylo smícháno s 225 μl ledově chlazeného methanolu a 750 μl ledově chlazeného methyl-terc-butyletheru (MTBE). Směs byla promíchána a inkubována na ledu po dobu 1 hodiny. Vzorky byly poté smíchány a vortexovány se 188 μl vody MS kvality obsahující vnitřní standardy (13C-laktát, 13C3-pyruvát, 13C-methionin a 13C6-isoleucin, zakoupené od Cambridge Isotope Laboratories). Směs byla poté centrifugována při 15 000 × g po dobu 10 minut při 4 °C a spodní fáze byla přenesena do dvou zkumavek (každá o 125 μl) pro LC-MS analýzu v pozitivním a negativním režimu. Nakonec byl vzorek odpařen do sucha ve vysokorychlostním vakuovém koncentrátoru.
Vysušené metabolity byly rekonstituovány ve 120 μl 80% acetonitrilu, vortexovány po dobu 5 minut a centrifugovány při 15 000 × g po dobu 10 minut při 4 °C. Supernatanty byly převedeny do jantarových skleněných lahviček s mikrovložkami pro metabolomické studie. Necílená metabolomická analýza na platformě ultravýkonné kapalinové chromatografie s hmotnostní spektrometrií s vysokým rozlišením (UPLC-HRMS). Metabolity byly separovány pomocí systému Dionex Ultimate 3000 UPLC a kolony ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters). V režimu pozitivních iontů byly mobilní fáze 95 % (A) a 50 % acetonitrilu (B), každá obsahující 10 mmol/l octanu amonného a 0,1 % kyseliny mravenčí. V negativním režimu obsahovaly mobilní fáze A a B 95 %, respektive 50 % acetonitrilu, obě fáze obsahovaly 10 mmol/l octanu amonného, pH = 9. Gradientní program byl následující: 0–0,5 min, 2 % B; 0,5–12 min, 2–50 % B; 12–14 min, 50–98 % B; 14–16 min, 98 % B; 16–16,1 min, 98 % –2 % B; 16,1–20 min, 2 % B. Kolona byla udržována na 40 °C a vzorek na 10 °C v autosampleru. Průtok byl 0,3 ml/min, vstřikovaný objem byl 3 μl. Hmotnostní spektrometr Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) se zdrojem elektrosprejové ionizace (ESI) byl provozován v režimu plného skenování a propojen s monitorovacím režimem ddMS2 pro sběr velkých objemů dat. Parametry MS byly nastaveny následovně: rozprašovací napětí +3,8 kV/- 3,2 kV, teplota kapiláry 320 °C, ochranný plyn 40 arb, pomocný plyn 10 arb, teplota ohřívače sondy 350 °C, skenovací rozsah 70–1050 m/h, rozlišení 70 000. Data byla získána pomocí programu Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Pro posouzení kvality dat byly vytvořeny sdružené vzorky pro kontrolu kvality (QC) odebráním 10 μl alikvotních podílů supernatantu z každého vzorku. Na začátku analytické sekvence bylo analyzováno šest injekcí vzorků pro kontrolu kvality, aby se posoudila stabilita systému UPLC-MS. Vzorky pro kontrolu kvality jsou poté periodicky zaváděny do šarže. Všech 11 šarží vzorků séra v této studii bylo analyzováno pomocí LC-MS. Alikvotní podíly směsi sér od 100 zdravých dárců byly použity jako referenční materiál v příslušných šaržích pro monitorování procesu extrakce a úpravu vlivů mezi šaržemi. Necílená metabolomická analýza discovery kohorty, interní validační kohorty a externí validační kohorty byla provedena v Metabolomickém centru Univerzity Sun Yat-sena. Externí laboratoř Analytického a testovacího centra Technologické univerzity v Guangdongu také analyzovala 40 vzorků z externí kohorty, aby otestovala výkonnost klasifikačního modelu.
Po extrakci a rekonstituci byla absolutní kvantifikace sérových metabolitů měřena pomocí ultravysokoúčinné kapalinové chromatografie s tandemovou hmotnostní spektrometrií (Agilent 6495 trojitý kvadrupól) s elektrosprejovou ionizací (ESI) v režimu monitorování více reakcí (MRM). K oddělení metabolitů byla použita kolona ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters). Mobilní fáze se skládala z 90 % (A) a 5 % acetonitrilu (B) s 10 mmol/l octanu amonného a 0,1% roztoku amoniaku. Gradientní program byl následující: 0–1,5 min, 0 % B; 1,5–6,5 min, 0–15 % B; 6,5–8 min, 15 % B; 8–8,5 min, 15 %–0 % B; 8,5–11,5 min, 0 % B. Kolona byla udržována na 40 °C a vzorek na 10 °C v automatickém vzorkovači. Průtoková rychlost byla 0,3 ml/min a vstřikovaný objem byl 1 μl. Parametry MS byly nastaveny následovně: kapilární napětí ±3,5 kV, tlak v nebulizéru 35 psi, průtok plášťového plynu 12 l/min, teplota plášťového plynu 350 °C, teplota sušicího plynu 250 °C a průtok sušicího plynu 14 l/min. MRM konverze tryptofanu, pyruvátu, laktátu, hypoxanthinu a xanthinu byly 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 a 151,0–107,9. Data byla shromážděna pomocí programu Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies). U vzorků séra byl tryptofan, pyruvát, laktát, hypoxanthin a xanthin kvantifikován pomocí kalibračních křivek standardních směsných roztoků. U vzorků buněk byl obsah tryptofanu normalizován na interní standard a hmotnost buněčných proteinů.
Extrakce píku (m/z a retenční čas (RT)) byla provedena pomocí Compound Discovery 3.1 a TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific). Aby se eliminovaly potenciální rozdíly mezi šaržemi, byl každý charakteristický pík testovaného vzorku dělen charakteristickým píkem referenčního materiálu ze stejné šarže, aby se získala relativní abundance. Relativní směrodatné odchylky interních standardů před a po standardizaci jsou uvedeny v doplňkové tabulce 6. Rozdíly mezi oběma skupinami byly charakterizovány mírou falešných objevů (FDR<0,05, Wilcoxonův test znaménkových pořadových řad) a násobnou změnou (>1,2 nebo <0,83). Nezpracovaná MS data extrahovaných znaků a MS data korigovaná referenčním sérem jsou uvedena v doplňkových datech 1 a doplňkových datech 2. Anotace píku byla provedena na základě čtyř definovaných úrovní identifikace, včetně identifikovaných metabolitů, údajně anotovaných sloučenin, údajně charakterizovaných tříd sloučenin a neznámých sloučenin 22. Na základě vyhledávání v databázi v Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider) byly jako meziprodukty mezi diferenciálním metabolomem nakonec vybrány biologické sloučeniny s validovanými standardy odpovídajícími MS/MS nebo anotacemi přesné shody v mzCloud (skóre > 85) nebo Chemspider. Anotace píků pro každý znak jsou uvedeny v doplňkových datech 3. Pro univariační analýzu sumárně normalizované abundance metabolitů byl použit MetaboAnalyst 5.0. MetaboAnalyst 5.0 také vyhodnotil analýzu obohacení dráhy KEGG na základě významně odlišných metabolitů. Analýza hlavních komponent (PCA) a diskriminační analýza parciálních nejmenších čtverců (PLS-DA) byly analyzovány pomocí softwarového balíčku ropls (v.1.26.4) s normalizací zásobníku a automatickým škálováním. Optimální model biomarkeru metabolitů pro predikci malignity uzlíků byl generován pomocí binární logistické regrese s nejmenším absolutním smrštěním a selekčním operátorem (LASSO, balíček R v.4.1-3). Výkonnost diskriminačního modelu v detekčních a validačních sadách byla charakterizována odhadem AUC na základě ROC analýzy podle balíčku pROC (v.1.18.0.). Optimální mezní hodnota pravděpodobnosti byla získána na základě maximálního Youdenova indexu modelu (senzitivita + specificita – 1). Vzorky s hodnotami menšími nebo většími než prahová hodnota budou predikovány jako benigní uzliny a plicní adenokarcinom.
Buňky A549 (#CCL-185, American Type Culture Collection) byly pěstovány v médiu F-12K obsahujícím 10 % FBS. Sekvence krátké vlásenkové RNA (shRNA) cílící na SLC7A5 a necílená kontrola (NC) byly vloženy do lentivirového vektoru pLKO.1-puro. Antisense sekvence shSLC7A5 jsou následující: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). Protilátky proti SLC7A5 (#5347) a tubulinu (#2148) byly zakoupeny od společnosti Cell Signaling Technology. Protilátky proti SLC7A5 a tubulinu byly použity v ředění 1:1000 pro Western blot analýzu.
Glykolytický stresový test Seahorse XF měří hladiny extracelulárního okyselení (ECAR). V testu byly postupně podávány glukóza, oligomycin A a 2-DG za účelem testování buněčné glykolytické kapacity měřené pomocí ECAR.
Buňky A549 transfekované necílovou kontrolou (NC) a shSLC7A5 (Sh1, Sh2) byly přes noc umístěny do misek o průměru 10 cm. Buněčné metabolity byly extrahovány 1 ml ledově chlazeného 80% vodného methanolu. Buňky v methanolovém roztoku byly seškrábnuty, shromážděny do nové zkumavky a centrifugovány při 15 000 × g po dobu 15 minut při 4 °C. Odebrání 800 µl supernatantu a vysušení pomocí vysokorychlostního vakuového koncentrátoru. Vysušené pelety metabolitů byly poté analyzovány na hladiny tryptofanu pomocí LC-MS/MS, jak je popsáno výše. Buněčné hladiny NAD(H) v buňkách A549 (NC a shSLC7A5) byly měřeny pomocí kvantitativní kolorimetrické soupravy NAD+/NADH (#K337, BioVision) podle pokynů výrobce. Hladiny proteinů byly měřeny pro každý vzorek za účelem normalizace množství metabolitů.
K předběžnému stanovení velikosti vzorku nebyly použity žádné statistické metody. Předchozí metabolomické studie zaměřené na objev biomarkerů15,18 byly považovány za srovnávací hodnoty pro stanovení velikosti a ve srovnání s těmito zprávami byl náš vzorek adekvátní. Ze studijní kohorty nebyly vyloučeny žádné vzorky. Vzorky séra byly náhodně zařazeny do objevovací skupiny (306 případů, 74,6 %) a interní validační skupiny (104 případů, 25,4 %) pro necílené metabolomické studie. Z objevovací sady pro cílené metabolomické studie jsme také náhodně vybrali 70 případů z každé skupiny. Během sběru a analýzy dat LC-MS nebylo výzkumníkům známo zařazení do skupin. Statistické analýzy metabolomických dat a buněčných experimentů jsou popsány v příslušných částech Výsledky, Legendy obrázků a Metody. Kvantifikace buněčného tryptofanu, NADT a glykolytické aktivity byla provedena třikrát nezávisle se shodnými výsledky.
Více informací o designu studie naleznete v abstraktu zprávy o přirozeném portfoliu, který je součástí tohoto článku.
Nezpracovaná MS data extrahovaných znaků a normalizovaná MS data referenčního séra jsou uvedena v doplňkových datech 1 a 2. Anotace píků pro diferenciální znaky jsou uvedeny v doplňkových datech 3. Datový soubor LUAD TCGA lze stáhnout z https://portal.gdc.cancer.gov/. Vstupní data pro vykreslení grafu jsou uvedena ve zdrojových datech. Zdrojová data jsou uvedena pro tento článek.
Národní skupina pro studium plicního screeningu atd. Snížení úmrtnosti na rakovinu plic pomocí nízkodávkové počítačové tomografie. Severní Anglie. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR a Prophet, PC. Screening rakoviny plic s využitím nízkodávkové spirální počítačové tomografie: výsledky Národní studie plicního screeningu (NLST). J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ a kol. Snížení úmrtnosti na rakovinu plic pomocí volumetrického CT screeningu v randomizované studii. Severní Anglie. J. Med. 382, 503–513 (2020).
Čas zveřejnění: 18. září 2023