Diferenciální diagnostika plicních uzlů identifikovaných pomocí počítačové tomografie (CT) zůstává v klinické praxi výzvou.Zde charakterizujeme globální metabolom 480 vzorků séra, včetně zdravých kontrol, benigních plicních uzlů a adenokarcinomu plic I. stadia.Adenokarcinomy vykazují jedinečné metabolomické profily, zatímco benigní uzliny a zdraví jedinci mají vysokou podobnost v metabolomických profilech.Ve skupině objevů (n = 306) byla identifikována sada 27 metabolitů k rozlišení mezi benigními a maligními uzly.AUC diskriminačního modelu ve skupině s interní validací (n = 104) a externí validací (n = 111) byla 0,915, respektive 0,945.Analýza dráhy odhalila zvýšené glykolytické metabolity spojené se snížením tryptofanu v séru plicního adenokarcinomu ve srovnání s benigními uzly a zdravými kontrolami a navrhla, že vychytávání tryptofanu podporuje glykolýzu v buňkách rakoviny plic.Naše studie zdůrazňuje hodnotu biomarkerů sérových metabolitů při hodnocení rizika plicních nodulů detekovaných CT.
Včasná diagnóza je zásadní pro zlepšení přežití pacientů s rakovinou.Výsledky americké Národní studie pro screening rakoviny plic (NLST) a evropské studie NELSON ukázaly, že screening pomocí nízkodávkové počítačové tomografie (LDCT) může významně snížit mortalitu na rakovinu plic u vysoce rizikových skupin1,2,3.Od rozšířeného používání LDCT pro screening rakoviny plic se výskyt náhodných rentgenových nálezů asymptomatických plicních uzlů nadále zvyšuje 4 .Plicní uzliny jsou definovány jako fokální opacity do průměru 3 cm 5 .Potýkáme se s obtížemi při posuzování pravděpodobnosti malignity a při řešení velkého počtu plicních uzlů zjištěných náhodně při LDCT.Omezení CT může vést k častým kontrolám a falešně pozitivním výsledkům, což vede ke zbytečné intervenci a přeléčení6.Existuje proto potřeba vyvinout spolehlivé a užitečné biomarkery pro správnou identifikaci rakoviny plic v časných stádiích a odlišení většiny benigních uzlů při počáteční detekci 7 .
Komplexní molekulární analýza krve (sérum, plazma, mononukleární buňky periferní krve), včetně genomiky, proteomiky nebo metylace DNA8,9,10, vedla k rostoucímu zájmu o objev diagnostických biomarkerů pro rakovinu plic.Mezitím metabolomické přístupy měří konečné buněčné produkty, které jsou ovlivněny endogenními a exogenními účinky, a proto se používají k predikci nástupu a výsledku onemocnění.Kapalinová chromatografie-tandemová hmotnostní spektrometrie (LC-MS) je široce používaná metoda pro metabolomické studie díky své vysoké citlivosti a velkému dynamickému rozsahu, který může pokrýt metabolity s různými fyzikálně-chemickými vlastnostmi11,12,13.Přestože k identifikaci biomarkerů spojených s diagnózou karcinomu plic14,15,16,17 a účinností léčby byla použita globální metabolomická analýza plazmy/séra,18 klasifikátory sérových metabolitů pro rozlišení mezi benigními a maligními plicními uzly je třeba ještě hodně prostudovat.- masivní výzkum.
Adenokarcinom a spinocelulární karcinom jsou dva hlavní podtypy nemalobuněčného karcinomu plic (NSCLC).Různé CT screeningové testy ukazují, že adenokarcinom je nejčastějším histologickým typem rakoviny plic1,19,20,21.V této studii jsme použili ultravýkonnou kapalinovou chromatografii-hmotovou spektrometrii s vysokým rozlišením (UPLC-HRMS) k provedení metabolomické analýzy na celkem 695 vzorcích séra, včetně zdravých kontrol, benigních plicních uzlin a CT detekovaných ≤3 cm.Screening adenokarcinomu plic I. stadia.Identifikovali jsme panel sérových metabolitů, které odlišují plicní adenokarcinom od benigních nodulů a zdravých kontrol.Analýza obohacení dráhy odhalila, že abnormální metabolismus tryptofanu a glukózy jsou běžné změny u adenokarcinomu plic ve srovnání s benigními uzly a zdravými kontrolami.Nakonec jsme vytvořili a validovali sérový metabolický klasifikátor s vysokou specificitou a citlivostí k rozlišení mezi maligními a benigními plicními uzlinami detekovanými pomocí LDCT, což může pomoci při časné diferenciální diagnostice a hodnocení rizik.
V této studii byly retrospektivně odebrány vzorky séra odpovídající pohlaví a věku od 174 zdravých kontrol, 292 pacientů s benigními plicními uzly a 229 pacientů s adenokarcinomem plic I. stadia.Demografické charakteristiky 695 subjektů jsou uvedeny v doplňkové tabulce 1.
Jak je znázorněno na obrázku 1a, v Sun Yat-sen University Cancer Center bylo odebráno celkem 480 vzorků séra, včetně 174 zdravých kontrol (HC), 170 benigních uzlin (BN) a 136 vzorků plicního adenokarcinomu (LA) stadia I.Discovery kohorta pro necílené metabolomické profilování pomocí ultravýkonné kapalinové chromatografie s vysokým rozlišením hmotnostní spektrometrie (UPLC-HRMS).Jak je znázorněno na doplňkovém obrázku 1, byly identifikovány rozdílné metabolity mezi LA a HC, LA a BN, aby se vytvořil klasifikační model a dále se prozkoumaly analýzy diferenciálních cest.104 vzorků odebraných Cancer Center Sun Yat-sen University a 111 vzorků odebraných dvěma dalšími nemocnicemi bylo podrobeno interní a externí validaci.
Studijní populace v kohortě objevů, která podstoupila globální metabolomickou analýzu séra pomocí ultravýkonné kapalinové chromatografie s vysokým rozlišením hmotnostní spektrometrie (UPLC-HRMS).b Částečná diskriminační analýza metodou nejmenších čtverců (PLS-DA) celkového metabolomu 480 vzorků séra ze studijní kohorty, včetně zdravých kontrol (HC, n = 174), benigních uzlů (BN, n = 170) a adenokarcinomu plic stadia I (Los Angeles, n = 136).+ESI, pozitivní elektrosprejový ionizační režim, -ESI, negativní elektrosprejový ionizační režim.c–e metabolity s významně odlišnými abundancemi ve dvou daných skupinách (dvoustranný Wilcoxonův znaménkový rank test, hodnota p upravená podle míry falešného objevu, FDR <0,05) jsou zobrazeny červeně (násobná změna > 1,2) a modře (násobná změna < 0,83) .) zobrazený na grafice sopky.f Hierarchická shluková tepelná mapa ukazující významné rozdíly v počtu anotovaných metabolitů mezi LA a BN.Zdrojová data jsou poskytována ve formě zdrojových datových souborů.
Celkový sérový metabolom 174 HC, 170 BN a 136 LA v objevené skupině byl analyzován pomocí analýzy UPLC-HRMS.Nejprve ukazujeme, že vzorky kontroly kvality (QC) se těsně shlukují ve středu modelu analýzy hlavních komponent (PCA) bez dozoru, což potvrzuje stabilitu výkonu současné studie (doplňkový obrázek 2).
Jak ukazuje částečná diskriminační analýza nejmenších čtverců (PLS-DA) na obrázku 1b, zjistili jsme, že existují jasné rozdíly mezi LA a BN, LA a HC v pozitivních (+ESI) a negativních (-ESI) režimech elektrosprejové ionizace. .izolovaný.Nebyly však zjištěny žádné významné rozdíly mezi BN a HC v podmínkách +ESI a -ESI.
Zjistili jsme 382 rozdílů mezi LA a HC, 231 rozdílů mezi LA a BN a 95 rozdílů mezi BN a HC (Wilcoxonův znaménkový rank test, FDR <0,05 a vícenásobná změna >1,2 nebo <0,83) (obrázek .1c-e )..Vrcholy byly dále anotovány (doplňková data 3) proti databázi (knihovna mzCloud/HMDB/Chemspider) hodnotou m/z, retenčním časem a fragmentačním hmotnostním spektrem (podrobnosti popsané v části Metody)22.Nakonec bylo identifikováno 33 a 38 anotovaných metabolitů s významnými rozdíly v abundanci pro LA versus BN (obrázek 1f a doplňková tabulka 2) a LA versus HC (doplňkový obrázek 3 a doplňková tabulka 2).Na rozdíl od toho byly v BN a HC identifikovány pouze 3 metabolity s významnými rozdíly v abundanci (doplňková tabulka 2), což je v souladu s překrýváním mezi BN a HC v PLS-DA.Tyto rozdílné metabolity pokrývají širokou škálu biochemikálií (doplňkový obrázek 4).Celkově vzato tyto výsledky ukazují významné změny v sérovém metabolomu, které odrážejí maligní transformaci raného stadia rakoviny plic ve srovnání s benigními plicními uzly nebo zdravými subjekty.Mezitím podobnost sérového metabolomu BN a HC naznačuje, že benigní plicní noduly mohou sdílet mnoho biologických charakteristik se zdravými jedinci.Vzhledem k tomu, že genové mutace receptoru pro epidermální růstový faktor (EGFR) jsou běžné u plicního adenokarcinomu podtypu 23, snažili jsme se určit dopad řidičských mutací na sérový metabolom.Poté jsme analyzovali celkový metabolomický profil 72 případů se stavem EGFR ve skupině s adenokarcinomem plic.Je zajímavé, že jsme našli srovnatelné profily mezi pacienty s mutantem EGFR (n = 41) a pacienty s divokým typem EGFR (n = 31) v analýze PCA (doplňkový obrázek 5a).Identifikovali jsme však 7 metabolitů, jejichž abundance byla významně změněna u pacientů s mutací EGFR ve srovnání s pacienty s divokým typem EGFR (t test, p < 0,05 a násobná změna > 1,2 nebo < 0,83) (doplňkový obrázek 5b).Většina těchto metabolitů (5 ze 7) jsou acylkarnitiny, které hrají důležitou roli v drahách oxidace mastných kyselin.
Jak je znázorněno v pracovním postupu zobrazeném na obrázku 2a, biomarkery pro klasifikaci uzlin byly získány pomocí operátorů nejmenšího absolutního zmenšení a výběru na základě 33 rozdílných metabolitů identifikovaných v LA (n = 136) a BN (n = 170).Nejlepší kombinace proměnných (LASSO) – binární logistický regresní model.K testování spolehlivosti modelu byla použita desetinásobná křížová validace.Výběr proměnných a regularizace parametrů jsou upraveny penalizací za maximalizaci pravděpodobnosti s parametrem λ24.Globální metabolomická analýza byla dále provedena nezávisle ve skupinách interní validace (n = 104) a externí validace (n = 111), aby se otestovala klasifikační výkonnost diskriminačního modelu.Výsledkem bylo, že 27 metabolitů v souboru objevů bylo identifikováno jako nejlepší diskriminační model s největší střední hodnotou AUC (obr. 2b), z nichž 9 mělo zvýšenou aktivitu a 18 sníženou aktivitu v LA ve srovnání s BN (obr. 2c).
Pracovní postup pro vytvoření klasifikátoru plicních nodulů, včetně výběru nejlepšího panelu sérových metabolitů v souboru pro objevování pomocí binárního logistického regresního modelu prostřednictvím desetinásobné křížové validace a vyhodnocení prediktivní výkonnosti v interních a externích validačních souborech.b Statistika křížové validace regresního modelu LASSO pro výběr metabolických biomarkerů.Čísla uvedená výše představují průměrný počet biomarkerů vybraných při daném A.Červená tečkovaná čára představuje průměrnou hodnotu AUC při odpovídající lambda.Šedé chybové úsečky představují minimální a maximální hodnoty AUC.Tečkovaná čára označuje nejlepší model s 27 vybranými biomarkery.AUC, plocha pod křivkou provozní charakteristiky přijímače (ROC).c Násobné změny 27 vybraných metabolitů ve skupině LA ve srovnání se skupinou BN ve skupině objevů.Červený sloupec – aktivace.Modrý sloupec je pokles.d–f Křivky provozní charakteristiky přijímače (ROC) ukazující sílu diskriminačního modelu založeného na 27 kombinacích metabolitů v sadách pro objevování, interní a externí validaci.Zdrojová data jsou poskytována ve formě zdrojových datových souborů.
Na základě vážených regresních koeficientů těchto 27 metabolitů byl vytvořen predikční model (doplňková tabulka 3).ROC analýza založená na těchto 27 metabolitech poskytla hodnotu plochy pod křivkou (AUC) 0,933, citlivost objevené skupiny byla 0,868 a specificita byla 0,859 (obr. 2d).Mezitím mezi 38 anotovanými rozdílnými metabolity mezi LA a HC dosáhla sada 16 metabolitů AUC 0,902 se senzitivitou 0,801 a specificitou 0,856 při rozlišování LA od HC (doplňkový obrázek 6a-c).Byly také porovnány hodnoty AUC založené na různých prahových hodnotách násobné změny pro různé metabolity.Zjistili jsme, že klasifikační model fungoval nejlépe při rozlišování mezi LA a BN (HC), když byla úroveň násobku změny nastavena na 1,2 oproti 1,5 nebo 2,0 (doplňkový obrázek 7a,b).Klasifikační model založený na 27 skupinách metabolitů byl dále validován v interních a externích kohortách.AUC byla 0,915 (senzitivita 0,867, specificita 0,811) pro interní validaci a 0,945 (senzitivita 0,810, specificita 0,979) pro externí validaci (obr. 2e, f).Pro posouzení mezilaboratorní účinnosti bylo 40 vzorků z externí kohorty analyzováno v externí laboratoři, jak je popsáno v části Metody.Přesnost klasifikace dosáhla AUC 0,925 (doplňkový obrázek 8).Protože plicní spinocelulární karcinom (LUSC) je druhým nejčastějším podtypem nemalobuněčného karcinomu plic (NSCLC) po plicním adenokarcinomu (LUAD), testovali jsme také ověřenou potenciální užitečnost metabolických profilů.BN a 16 případů LUSC.AUC diskriminace mezi LUSC a BN byla 0,776 (doplňkový obrázek 9), což ukazuje na horší schopnost ve srovnání s diskriminací mezi LUAD a BN.
Studie ukázaly, že velikost uzlin na CT obrazech pozitivně koreluje s pravděpodobností malignity a zůstává hlavním determinantem léčby uzlin25,26,27.Analýza dat z velké kohorty screeningové studie NELSON ukázala, že riziko malignity u subjektů s uzlinami < 5 mm bylo dokonce podobné jako u subjektů bez uzlin28.Proto je minimální velikost vyžadující pravidelné CT monitorování 5 mm, jak doporučuje British Thoracic Society (BTS), a 6 mm, jak doporučuje Fleischner Society 29 .Uzly větší než 6 mm a bez zjevných benigních znaků, nazývané indeterminate pulmonary nodules (IPN), však zůstávají hlavní výzvou při hodnocení a léčbě v klinické praxi30,31.Dále jsme zkoumali, zda velikost uzlu ovlivnila metabolomické podpisy pomocí sdružených vzorků z kohort pro objev a interní validaci.Se zaměřením na 27 validovaných biomarkerů jsme nejprve porovnali PCA profily HC a BN sub-6 mm metabolomů.Zjistili jsme, že většina datových bodů pro HC a BN se překrývala, což dokazuje, že hladiny metabolitů v séru byly podobné v obou skupinách (obr. 3a).Mapy rysů v různých velikostních rozmezích zůstaly zachovány v BN a LA (obr. 3b, c), zatímco byla pozorována separace mezi maligními a benigními uzly v rozmezí 6–20 mm (obr. 3d).Tato kohorta měla AUC 0,927, specificitu 0,868 a senzitivitu 0,820 pro predikci malignity uzlů o velikosti 6 až 20 mm (obr. 3e, f).Naše výsledky ukazují, že klasifikátor dokáže zachytit metabolické změny způsobené časnou maligní transformací bez ohledu na velikost uzliny.
ad Porovnání PCA profilů mezi specifikovanými skupinami na základě metabolického klasifikátoru 27 metabolitů.CC a BN < 6 mm.b BN < 6 mm vs BN 6–20 mm.u LA 6–20 mm versus LA 20–30 mm.g BN 6–20 mm a LA 6–20 mm.GC, n = 174;BN < 6 mm, n = 153;BN 6–20 mm, n = 91;LA 6–20 mm, n = 89;LA 20–30 mm, n = 77. e Křivka provozní charakteristiky přijímače (ROC) ukazující výkon diskriminačního modelu pro uzly 6–20 mm.f Hodnoty pravděpodobnosti byly vypočteny na základě modelu logistické regrese pro uzly o rozměrech 6–20 mm.Šedá tečkovaná čára představuje optimální mezní hodnotu (0,455).Výše uvedená čísla představují procento případů předpokládaných pro Los Angeles.Použijte dvoustranný Studentův t test.PCA, analýza hlavních komponent.AUC plocha pod křivkou.Zdrojová data jsou poskytována ve formě zdrojových datových souborů.
Dále byly vybrány čtyři vzorky (ve věku 44–61 let) s podobnou velikostí plicních uzlin (7–9 mm), aby ilustrovaly účinnost navrhovaného modelu predikce malignity (obr. 4a, b).Při počátečním screeningu se případ 1 prezentoval jako solidní uzel s kalcifikací, což je rys spojený s benigním onemocněním, zatímco případ 2 se prezentoval jako neurčitý částečně pevný uzel bez zjevných benigních rysů.Tři kola kontrolních CT vyšetření ukázala, že tyto případy zůstaly stabilní po dobu 4 let, a byly proto považovány za benigní noduly (obr. 4a).Ve srovnání s klinickým hodnocením sériových CT skenů jednorázová analýza metabolitů séra se současným modelem klasifikátoru rychle a správně identifikovala tyto benigní uzliny na základě pravděpodobnostních omezení (tabulka 1).Obrázek 4b v případě 3 ukazuje uzel se známkami pleurální retrakce, která je nejčastěji spojena s malignitou32.Případ 4 prezentován jako neurčitý částečně pevný uzlík bez známek benigní příčiny.Všechny tyto případy byly predikovány jako maligní podle modelu klasifikátoru (tabulka 1).Hodnocení plicního adenokarcinomu bylo prokázáno histopatologickým vyšetřením po resekci plic (obr. 4b).U sady externí validace metabolický klasifikátor přesně předpověděl dva případy neurčitých plicních uzlů větších než 6 mm (doplňkový obrázek 10).
CT snímky axiálního okna plic dvou případů benigních uzlin.V případě 1 prokázalo CT po 4 letech stabilní solidní uzel o velikosti 7 mm s kalcifikací v pravém dolním laloku.V případě 2 CT vyšetření po 5 letech odhalilo stabilní, částečně solidní uzel o průměru 7 mm v pravém horním laloku.b CT snímky plic v axiálním okně a odpovídající patologické studie dvou případů adenokarcinomu stadia I před resekcí plic.Případ 3 odhalil uzel o průměru 8 mm v pravém horním laloku s pleurální retrakcí.Případ 4 odhalil částečně pevnou zabroušenou skleněnou uzlinu o velikosti 9 mm v levém horním laloku.Barvení resekované plicní tkáně hematoxylinem a eosinem (H&E) (měřítko = 50 μm) prokazující acinární růstový vzor plicního adenokarcinomu.Šipky označují uzly detekované na CT snímcích.H&E snímky jsou reprezentativní snímky více (>3) mikroskopických polí zkoumaných patologem.
Celkově naše výsledky ukazují potenciální hodnotu biomarkerů sérových metabolitů v diferenciální diagnostice plicních nodulů, což může představovat problémy při hodnocení CT screeningu.
Na základě ověřeného panelu diferenciálních metabolitů jsme se snažili identifikovat biologické koreláty hlavních metabolických změn.Analýza obohacení KEGG dráhy provedená MetaboAnalystem identifikovala 6 běžných významně změněných drah mezi dvěma danými skupinami (LA vs. HC a LA vs. BN, upraveno p ≤ 0,001, účinek > 0,01).Tyto změny byly charakterizovány poruchami metabolismu pyruvátu, metabolismu tryptofanu, metabolismu niacinu a nikotinamidu, glykolýzy, cyklu TCA a metabolismu purinů (obr. 5a).Poté jsme dále provedli cílenou metabolomiku k ověření hlavních změn pomocí absolutní kvantifikace.Stanovení běžných metabolitů v běžně pozměněných drahách pomocí trojité kvadrupólové hmotnostní spektrometrie (QQQ) za použití autentických standardů metabolitů.Demografické charakteristiky cílového vzorku metabolomické studie jsou uvedeny v doplňkové tabulce 4. V souladu s našimi globálními výsledky metabolomiky kvantitativní analýza potvrdila, že hypoxantin a xantin, pyruvát a laktát byly u LA zvýšeny ve srovnání s BN a HC (obr. 5b, c, p <0,05).Mezi BN a HC však nebyly nalezeny žádné významné rozdíly v těchto metabolitech.
Analýza obohacení KEGG dráhy významně odlišných metabolitů ve skupině LA ve srovnání se skupinami BN a HC.Byl použit dvoustranný Globaltest a hodnoty p byly upraveny pomocí Holm-Bonferroniho metody (upraveno p ≤ 0,001 a velikost účinku > 0,01).b–d Houslové grafy ukazující hladiny hypoxantinu, xanthinu, laktátu, pyruvátu a tryptofanu v séru HC, BN a LA stanovené pomocí LC-MS/MS (n = 70 na skupinu).Bílé a černé tečkované čáry označují medián a kvartil.e Houslový graf ukazující normalizovanou Log2TPM (transkripty na milion) mRNA expresi SLC7A5 a QPRT u plicního adenokarcinomu (n = 513) ve srovnání s normální plicní tkání (n = 59) v souboru dat LUAD-TCGA.Bílý rámeček představuje mezikvartilové rozmezí, vodorovná černá čára uprostřed představuje medián a svislá černá čára vyčnívající z rámečku představuje 95% interval spolehlivosti (CI).f Pearsonův korelační graf exprese SLC7A5 a GAPDH u plicního adenokarcinomu (n = 513) a normální plicní tkáně (n = 59) v souboru dat TCGA.Šedá oblast představuje 95% CI.r, Pearsonův korelační koeficient.g Normalizované buněčné hladiny tryptofanu v buňkách A549 transfekovaných nespecifickou kontrolou shRNA (NC) a shSLC7A5 (Sh1, Sh2) stanovené pomocí LC-MS/MS.Je uvedena statistická analýza pěti biologicky nezávislých vzorků v každé skupině.h Buněčné hladiny NADt (celkový NAD, včetně NAD+ a NADH) v A549 buňkách (NC) a SLC7A5 knockdown A549 buňkách (Sh1, Sh2).Je uvedena statistická analýza tří biologicky nezávislých vzorků v každé skupině.i Glykolytická aktivita buněk A549 před a po knockdownu SLC7A5 byla měřena rychlostí extracelulární acidifikace (ECAR) (n = 4 biologicky nezávislé vzorky na skupinu).2-DG,2-deoxy-D-glukóza.V (b–h) byl použit dvoustranný Studentův t test.V (g–i) představují chybové úsečky průměr ± SD, každý experiment byl proveden třikrát nezávisle a výsledky byly podobné.Zdrojová data jsou poskytována ve formě zdrojových datových souborů.
Vzhledem k významnému dopadu změněného metabolismu tryptofanu ve skupině LA jsme také hodnotili hladiny tryptofanu v séru ve skupinách HC, BN a LA pomocí QQQ.Zjistili jsme, že sérový tryptofan byl snížen u LA ve srovnání s HC nebo BN (p < 0,001, obrázek 5d), což je v souladu s předchozími zjištěními, že hladiny cirkulujícího tryptofanu jsou nižší u pacientů s rakovinou plic než u zdravých kontrol z kontrolní skupiny33,34 ,35.Další studie využívající PET/CT indikátor 11C-methyl-L-tryptofan zjistila, že doba retence tryptofanového signálu ve tkáni rakoviny plic byla významně prodloužena ve srovnání s benigními lézemi nebo normální tkání36.Předpokládáme, že pokles tryptofanu v LA séru může odrážet aktivní vychytávání tryptofanu buňkami rakoviny plic.
Je také známo, že konečným produktem kynureninové dráhy katabolismu tryptofanu je NAD+37,38, což je důležitý substrát pro reakci glyceraldehyd-3-fosfátu s 1,3-bisfosfoglycerátem při glykolýze39.Zatímco předchozí studie se zaměřovaly na roli katabolismu tryptofanu v imunitní regulaci, snažili jsme se objasnit souhru mezi dysregulací tryptofanu a glykolytickými cestami pozorovanými v současné studii.Člen 5 rodiny transportérů rozpuštěných látek (SLC7A5) je známý jako tryptofanový transportér43,44,45.Fosforibosyltransferáza kyseliny chinolinové (QPRT) je enzym umístěný za kynureninovou cestou, která přeměňuje kyselinu chinolinovou na NAMN46.Inspekce datového souboru LUAD TCGA odhalila, že jak SLC7A5, tak QPRT byly významně upregulovány v nádorové tkáni ve srovnání s normální tkání (obr. 5e).Toto zvýšení bylo pozorováno ve stádiích I a II, stejně jako ve stádiích III a IV adenokarcinomu plic (doplňkový obrázek 11), což ukazuje na časné poruchy metabolismu tryptofanu spojené s tumorigenezí.
Kromě toho soubor dat LUAD-TCGA ukázal pozitivní korelaci mezi expresí mRNA SLC7A5 a GAPDH ve vzorcích pacientů s rakovinou (r = 0,45, p = 1,55E-26, obrázek 5f).Naproti tomu nebyla nalezena žádná významná korelace mezi takovými genovými podpisy v normální plicní tkáni (r = 0,25, p = 0,06, obrázek 5f).Knockdown SLC7A5 (doplňkový obrázek 12) v buňkách A549 významně snížil hladiny buněčného tryptofanu a NAD(H) (obrázek 5g,h), což vedlo k oslabené glykolytické aktivitě měřené rychlostí extracelulární acidifikace (ECAR) (obrázek 1).5i).Na základě metabolických změn v séru a detekce in vitro tedy předpokládáme, že metabolismus tryptofanu může produkovat NAD+ prostřednictvím kynureninové dráhy a hrát důležitou roli při podpoře glykolýzy u rakoviny plic.
Studie ukázaly, že velký počet neurčitých plicních uzlů detekovaných pomocí LDCT může vést k potřebě dalších vyšetření, jako je PET-CT, plicní biopsie a přeléčení kvůli falešně pozitivní diagnóze malignity.31 Jak ukazuje obrázek 6, naše studie identifikovala panel sérových metabolitů s potenciální diagnostickou hodnotou, které mohou zlepšit stratifikaci rizika a následnou léčbu plicních nodulů detekovaných CT.
Plicní uzliny jsou hodnoceny pomocí nízkodávkové počítačové tomografie (LDCT) se zobrazovacími znaky naznačujícími benigní nebo maligní příčiny.Nejistý výsledek uzlů může vést k častým následným návštěvám, zbytečným intervencím a nadměrné léčbě.Zařazení sérových metabolických klasifikátorů s diagnostickou hodnotou může zlepšit hodnocení rizika a následnou léčbu plicních uzlů.PET pozitronová emisní tomografie.
Údaje z americké studie NLST a evropské studie NELSON naznačují, že screening vysoce rizikových skupin pomocí nízkodávkové počítačové tomografie (LDCT) může snížit úmrtnost na rakovinu plic1,3.Nejnáročnější však zůstává posouzení rizik a následná klinická léčba velkého počtu náhodných plicních uzlů detekovaných pomocí LDCT.Hlavním cílem je optimalizovat správnou klasifikaci stávajících protokolů založených na LDCT začleněním spolehlivých biomarkerů.
Některé molekulární biomarkery, jako jsou krevní metabolity, byly identifikovány porovnáním rakoviny plic se zdravými kontrolami15,17.V této studii jsme se zaměřili na aplikaci sérové metabolomické analýzy k rozlišení mezi benigními a maligními plicními uzlinami náhodně detekovanými LDCT.Porovnali jsme globální sérový metabolom zdravých kontrolních vzorků (HC), benigních plicních nodulů (BN) a vzorků plicního adenokarcinomu (LA) stadia I pomocí analýzy UPLC-HRMS.Zjistili jsme, že HC a BN měly podobné metabolické profily, zatímco LA vykazovaly významné změny ve srovnání s HC a BN.Identifikovali jsme dvě sady sérových metabolitů, které odlišují LA od HC a BN.
Současné schéma identifikace benigních a maligních uzlů založené na LDCT je založeno hlavně na velikosti, hustotě, morfologii a rychlosti růstu uzlů v čase30.Předchozí studie ukázaly, že velikost uzlů úzce souvisí s pravděpodobností rakoviny plic.I u vysoce rizikových pacientů je riziko malignity v uzlinách <6 mm <1 %.Riziko malignity u uzlů o velikosti 6 až 20 mm se pohybuje od 8 % do 64 %30.Fleischnerova společnost proto doporučuje pro rutinní sledování CT mezní průměr 6 mm.29 Hodnocení rizika a léčba neurčitých plicních uzlů (IPN) větších než 6 mm však nebyly adekvátně provedeny 31 .Současná léčba vrozené srdeční vady je obvykle založena na pozorném vyčkávání s častým CT monitorováním.
Na základě ověřeného metabolomu jsme poprvé prokázali překrytí metabolomických signatur mezi zdravými jedinci a benigními uzly <6 mm.Biologická podobnost je v souladu s předchozími nálezy CT, že riziko malignity pro uzliny <6 mm je stejně nízké jako pro subjekty bez uzlin.30 Je třeba poznamenat, že naše výsledky také ukazují, že benigní uzliny <6 mm a ≥6 mm mají vysoké podobnost v metabolomických profilech, což naznačuje, že funkční definice benigní etiologie je konzistentní bez ohledu na velikost uzlu.Moderní panely diagnostických sérových metabolitů tedy mohou poskytnout jediný test jako vylučovací test, když jsou uzliny zpočátku detekovány na CT a potenciálně snížit sériové monitorování.Ve stejné době stejný panel metabolických biomarkerů odlišil maligní uzliny velikosti ≥6 mm od benigních uzlin a poskytl přesné predikce pro IPN podobné velikosti a nejednoznačných morfologických znaků na CT snímcích.Tento klasifikátor sérového metabolismu fungoval dobře při predikci malignity uzlů ≥6 mm s AUC 0,927.Celkově naše výsledky naznačují, že jedinečné sérové metabolomické podpisy mohou specificky odrážet časné metabolické změny vyvolané nádorem a mají potenciální hodnotu jako prediktory rizika, nezávisle na velikosti uzlu.
Zejména adenokarcinom plic (LUAD) a spinocelulární karcinom (LUSC) jsou hlavními typy nemalobuněčného karcinomu plic (NSCLC).Vzhledem k tomu, že LUSC je silně spojena s užíváním tabáku47 a LUAD je nejběžnější histologií náhodných plicních uzlů detekovaných při CT screeningu48, byl náš klasifikační model speciálně vytvořen pro vzorky adenokarcinomu stadia I.Wang a kolegové se také zaměřili na LUAD a identifikovali devět lipidových signatur pomocí lipidomiky k rozlišení raného stadia rakoviny plic od zdravých jedinců17.Testovali jsme současný model klasifikátoru na 16 případech stádia I LUSC a 74 benigních nodulech a pozorovali jsme nízkou přesnost predikce LUSC (AUC 0,776), což naznačuje, že LUAD a LUSC mohou mít své vlastní metabolomické podpisy.Ukázalo se, že LUAD a LUSC se liší v etiologii, biologickém původu a genetických aberacích49.Do tréninkových modelů pro populační detekci rakoviny plic ve screeningových programech by proto měly být zahrnuty jiné typy histologie.
Zde jsme identifikovali šest nejčastěji změněných drah u adenokarcinomu plic ve srovnání se zdravými kontrolami a benigními uzly.Xanthin a hypoxanthin jsou běžné metabolity purinové metabolické dráhy.V souladu s našimi výsledky byly meziprodukty spojené s metabolismem purinů významně zvýšeny v séru nebo tkáních pacientů s plicním adenokarcinomem ve srovnání se zdravými kontrolami nebo pacienty v preinvazivním stadiu15,50.Zvýšené hladiny xanthinu a hypoxantinu v séru mohou odrážet anabolismus vyžadovaný rychle proliferujícími rakovinnými buňkami.Dysregulace metabolismu glukózy je dobře známým znakem metabolismu rakoviny51.Zde jsme pozorovali významný nárůst pyruvátu a laktátu ve skupině LA ve srovnání se skupinou HC a BN, což je v souladu s předchozími zprávami o abnormalitách glykolytické dráhy v profilech sérového metabolomu pacientů s nemalobuněčným karcinomem plic (NSCLC) a zdravé kontroly.výsledky jsou konzistentní52,53.
Důležité je, že jsme pozorovali inverzní korelaci mezi metabolismem pyruvátu a tryptofanu v séru plicních adenokarcinomů.Hladiny tryptofanu v séru byly sníženy ve skupině LA ve srovnání se skupinou HC nebo BN.Je zajímavé, že předchozí rozsáhlá studie využívající prospektivní kohortu zjistila, že nízké hladiny cirkulujícího tryptofanu byly spojeny se zvýšeným rizikem rakoviny plic 54 .Tryptofan je esenciální aminokyselina, kterou získáváme výhradně z potravy.Došli jsme k závěru, že sérová deplece tryptofanu u plicního adenokarcinomu může odrážet rychlou depleci tohoto metabolitu.Je dobře známo, že konečný produkt katabolismu tryptofanu prostřednictvím kynureninové dráhy je zdrojem de novo syntézy NAD+.Vzhledem k tomu, že NAD+ je produkován primárně cestou záchrany, význam NAD+ v metabolismu tryptofanu pro zdraví a nemoci zbývá určit46.Naše analýza databáze TCGA ukázala, že exprese transportéru tryptofanového solutu 7A5 (SLC7A5) byla významně zvýšena u plicního adenokarcinomu ve srovnání s normálními kontrolami a pozitivně korelovala s expresí glykolytického enzymu GAPDH.Předchozí studie se zaměřovaly především na roli katabolismu tryptofanu při potlačování protinádorové imunitní odpovědi40,41,42.Zde prokazujeme, že inhibice vychytávání tryptofanu knockdownem SLC7A5 v buňkách rakoviny plic vede k následnému snížení hladin buněčného NAD a současnému zeslabení glykolytické aktivity.V souhrnu naše studie poskytuje biologický základ pro změny v sérovém metabolismu spojené s maligní transformací plicního adenokarcinomu.
Mutace EGFR jsou nejčastější řidičské mutace u pacientů s NSCLC.V naší studii jsme zjistili, že pacienti s mutací EGFR (n = 41) měli celkové metabolomické profily podobné pacientům s divokým typem EGFR (n = 31), ačkoli jsme u pacientů s acylkarnitinem zjistili snížené sérové hladiny některých pacientů s mutací EGFR.Zavedenou funkcí acylkarnitinů je transport acylových skupin z cytoplazmy do mitochondriální matrice, což vede k oxidaci mastných kyselin za vzniku energie 55 .V souladu s našimi zjištěními nedávná studie také identifikovala podobné profily metabolomu mezi nádory EGFR mutant a EGFR divokého typu analýzou globálního metabolomu 102 vzorků tkáně plicního adenokarcinomu50.Je zajímavé, že obsah acylkarnitinu byl také nalezen ve skupině mutantů EGFR.To, zda změny v hladinách acylkarnitinu odrážejí metabolické změny vyvolané EGFR a základní molekulární dráhy, si tedy zaslouží další studii.
Na závěr naše studie zavádí sérový metabolický klasifikátor pro diferenciální diagnostiku plicních uzlin a navrhuje pracovní postup, který může optimalizovat hodnocení rizik a usnadnit klinickou léčbu na základě screeningu CT.
Tato studie byla schválena Etickou komisí Univerzitní onkologické nemocnice Sun Yat-sen, První přidruženou nemocnicí Univerzity Sun Yat-sen a Etickou komisí Univerzitní nemocnice pro rakovinu Zhengzhou.Ve skupinách pro objev a interní validaci bylo odebráno 174 sér od zdravých jedinců a 244 sér z benigních uzlin od jedinců podstupujících každoroční lékařské prohlídky na Oddělení kontroly a prevence rakoviny, Sun Yat-sen University Cancer Center a 166 benigních uzlin.sérum.Adenokarcinomy plic stadia I byly odebrány ze Sun Yat-sen University Cancer Center.V externí validační kohortě bylo 48 případů benigních uzlů, 39 případů plicního adenokarcinomu I. stadia z First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University a 24 případů I. stadia adenokarcinomu plic z Zhengzhou Cancer Hospital.Centrum Sun Yat-sen University Cancer Center také shromáždilo 16 případů spinocelulárního karcinomu plic stadia I, aby otestovalo diagnostickou schopnost zavedeného metabolického klasifikátoru (charakteristiky pacientů jsou uvedeny v doplňkové tabulce 5).Vzorky z kohorty objevů a kohorty interní validace byly shromážděny mezi lednem 2018 a květnem 2020. Vzorky pro kohortu pro externí validaci byly shromážděny mezi srpnem 2021 a říjnem 2022. Aby se minimalizovala genderová zaujatost, byl ke každé přiřazen přibližně stejný počet případů mužů a žen. kohorta.Discovery Team a Interní kontrolní tým.Pohlaví účastníka bylo určeno na základě self-reportu.Od všech účastníků byl získán informovaný souhlas a nebyla poskytnuta žádná kompenzace.Subjekty s benigními noduly byli ti, kteří měli stabilní skóre CT skenu po 2 až 5 letech v době analýzy, s výjimkou 1 případu z externího validačního vzorku, který byl odebrán před operací a diagnostikován histopatologií.S výjimkou chronické bronchitidy.Případy adenokarcinomu plic byly shromážděny před resekcí plic a potvrzeny patologickou diagnózou.Vzorky krve nalačno byly odebrány do zkumavek pro separaci séra bez jakýchkoli antikoagulancií.Vzorky krve byly sráženy po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti a poté centrifugovány při 2851 x g po dobu 10 minut při teplotě 4 °C, aby se shromáždil sérový supernatant.Sérové alikvoty byly zmraženy při -80 °C až do extrakce metabolitu.Oddělení prevence rakoviny a lékařského vyšetření Centra pro rakovinu univerzity Sun Yat-sen odebralo směs séra od 100 zdravých dárců, včetně stejného počtu mužů a žen ve věku 40 až 55 let.Byly smíchány stejné objemy každého donorového vzorku, výsledná směs byla rozdělena na alikvoty a skladována při -80 °C.Směs séra byla použita jako referenční materiál pro kontrolu kvality a standardizaci dat.
Referenční sérum a testované vzorky byly rozmraženy a metabolity byly extrahovány pomocí kombinované extrakční metody (MTBE/methanol/voda)56.Stručně řečeno, 50 μl séra bylo smícháno s 225 μl ledově chladného methanolu a 750 μl ledově chladného methyl-terc-butyletheru (MTBE).Směs se míchá a inkubuje se na ledu po dobu 1 hodiny.Vzorky byly poté smíchány a na vortexu smíchány se 188 μl MS-grade vody obsahující vnitřní standardy (13C-laktát, 13C3-pyruvát, 13C-methionin a 13C6-isoleucin, zakoupené od Cambridge Isotope Laboratories).Směs byla poté centrifugována při 15 000 x g po dobu 10 minut při 4 °C a spodní fáze byla přenesena do dvou zkumavek (125 ul každá) pro LC-MS analýzu v pozitivním a negativním režimu.Nakonec byl vzorek odpařen do sucha ve vysokorychlostním vakuovém koncentrátoru.
Vysušené metabolity byly rekonstituovány ve 120 μl 80% acetonitrilu, vortexovány po dobu 5 minut a centrifugovány při 15 000 x g po dobu 10 minut při teplotě 4 °C.Supernatanty byly přeneseny do lahviček z jantarového skla s mikrovložkami pro metabolomické studie.Necílená metabolomická analýza na platformě ultravýkonné kapalinové chromatografie s vysokým rozlišením hmotnostní spektrometrie (UPLC-HRMS).Metabolity byly separovány pomocí systému Dionex Ultimate 3000 UPLC a kolony ACQUITY BEH Amide (2,1 x 100 mm, 1,7 μm, Waters).V pozitivním iontovém módu byly mobilní fáze 95% (A) a 50% acetonitril (B), každá obsahující 10 mmol/l octanu amonného a 0,1% kyseliny mravenčí.V negativním režimu mobilní fáze A a B obsahovaly 95 % a 50 % acetonitrilu, obě fáze obsahovaly 10 mmol/l octanu amonného, pH = 9. Gradientový program byl následující: 0–0,5 min, 2 % B;0,5–12 min, 2–50 % B;12–14 min, 50–98 % B;14–16 min, 98 % B;16–16.1.min, 98-2 % B;16,1–20 min, 2 % B. Kolona byla udržována při 40 °C a vzorek při 10 °C v autosampleru.Průtok byl 0,3 ml/min, vstřikovací objem byl 3 μl.Hmotnostní spektrometr Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) se zdrojem elektrosprejové ionizace (ESI) byl provozován v režimu plného skenování a ve spojení s režimem monitorování ddMS2 pro sběr velkých objemů dat.Parametry MS byly nastaveny následovně: stříkací napětí +3,8 kV/- 3,2 kV, teplota kapiláry 320°C, ochranný plyn 40 arb, pomocný plyn 10 arb, teplota ohřívače sondy 350°C, snímací rozsah 70–1050 m/h, rozlišení.70 000. Data byla získána pomocí Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Pro posouzení kvality dat byly vytvořeny vzorky pro kontrolu kvality (QC) odebráním 10 μl alikvotů supernatantu z každého vzorku.Na začátku analytické sekvence bylo analyzováno šest nástřiků vzorků pro kontrolu kvality, aby se vyhodnotila stabilita systému UPLC-MS.Vzorky pro kontrolu kvality se pak periodicky zavádějí do šarže.Všech 11 šarží vzorků séra v této studii bylo analyzováno pomocí LC-MS.Alikvoty směsi sérového poolu od 100 zdravých dárců byly použity jako referenční materiál v příslušných šaržích pro monitorování extrakčního procesu a přizpůsobení účinkům šarže od šarže.Necílená metabolomická analýza kohorty objevů, kohorty interní validace a kohorty externí validace byla provedena v Metabolomickém centru Sun Yat-sen University.Externí laboratoř Guangdong University of Technology Analysis and Testing Center také analyzovala 40 vzorků z externí kohorty, aby otestovala výkon modelu klasifikátoru.
Po extrakci a rekonstituci byla absolutní kvantifikace sérových metabolitů měřena pomocí ultra-vysokoúčinné kapalinové chromatografie-tandemové hmotnostní spektrometrie (Agilent 6495 trojitý kvadrupól) se zdrojem elektrosprejové ionizace (ESI) v režimu monitorování více reakcí (MRM).K separaci metabolitů byla použita kolona ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters).Mobilní fáze sestávala z 90 % (A) a 5 % acetonitrilu (B) s 10 mmol/l octanu amonného a 0,1 % roztoku amoniaku.Gradientový program byl následující: 0–1,5 min, 0 % B;1,5–6,5 min, 0–15 % B;6,5–8 min, 15 % B;8–8,5 min, 15 %–0 % B;8,5–11,5 min, 0%B.Kolona byla udržována při 40 °C a vzorek při 10 °C v automatickém vzorkovači.Průtok byl 0,3 ml/min a objem nástřiku byl 1 μl.MS parametry byly nastaveny následovně: kapilární napětí ±3,5 kV, tlak nebulizéru 35 psi, průtok plynného pláště 12 l/min, teplota pláště plynu 350 °C, teplota sušícího plynu 250 °C a průtok sušícího plynu 14 l/min.Konverze MRM tryptofanu, pyruvátu, laktátu, hypoxanthinu a xanthinu byly 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 a 151,0–107.9 resp.Data byla shromážděna pomocí Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies).Pro vzorky séra byly tryptofan, pyruvát, laktát, hypoxanthin a xanthin kvantifikovány pomocí kalibračních křivek standardních směsných roztoků.U vzorků buněk byl obsah tryptofanu normalizován na vnitřní standard a hmotnost buněčného proteinu.
Extrakce píku (m/z a retenční čas (RT)) byla provedena pomocí Compound Discovery 3.1 a TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific).Aby se eliminovaly potenciální rozdíly mezi šaržemi, každý charakteristický pík testovaného vzorku byl vydělen charakteristickým vrcholem referenčního materiálu ze stejné šarže, aby se získala relativní hojnost.Relativní směrodatné odchylky vnitřních standardů před a po standardizaci jsou uvedeny v doplňkové tabulce 6. Rozdíly mezi těmito dvěma skupinami byly charakterizovány mírou falešného objevu (FDR<0,05, Wilcoxonův znaménkový rank test) a násobnou změnou (>1,2 nebo <0,83).Nezpracovaná MS data extrahovaných znaků a MS data korigovaná referenčním sérem jsou zobrazena v doplňkových datech 1 a doplňkových datech 2, v daném pořadí.Anotace vrcholu byla provedena na základě čtyř definovaných úrovní identifikace, včetně identifikovaných metabolitů, domněle anotovaných sloučenin, domněle charakterizovaných tříd sloučenin a neznámých sloučenin22.Na základě prohledávání databáze v Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider) byly nakonec vybrány biologické sloučeniny s MS/MS odpovídajícími validovaným standardům nebo anotace přesné shody v mzCloud (skóre > 85) nebo Chemspider jako meziprodukty mezi diferenciálním metabolomem.Anotace píku pro každou vlastnost jsou zahrnuty v doplňkových datech 3. MetaboAnalyst 5.0 byl použit pro jednorozměrnou analýzu množství normalizovaných metabolitů.MetaboAnalyst 5.0 také vyhodnotil analýzu obohacení KEGG dráhy na základě významně odlišných metabolitů.Analýza hlavních složek (PCA) a částečná diskriminační analýza nejmenších čtverců (PLS-DA) byly analyzovány pomocí softwarového balíku ropls (v.1.26.4) s normalizací zásobníku a automatickým škálováním.Optimální model biomarkeru metabolitu pro predikci malignity uzlu byl vytvořen pomocí binární logistické regrese s nejmenším absolutním smrštěním a selekčním operátorem (LASSO, R balíček v.4.1-3).Výkon diskriminačního modelu v sadě detekce a validace byl charakterizován odhadem AUC na základě ROC analýzy podle balíčku pROC (v.1.18.0.).Optimální hranice pravděpodobnosti byla získána na základě maximálního Youdenova indexu modelu (senzitivita + specificita – 1).Vzorky s hodnotami nižšími nebo vyššími než prahová hodnota budou predikovány jako benigní uzliny a plicní adenokarcinom.
Buňky A549 (č. CCL-185, American Type Culture Collection) byly pěstovány v médiu F-12K obsahujícím 10 % FBS.Krátké sekvence vlásenkové RNA (shRNA) zacílené na SLC7A5 a necílenou kontrolu (NC) byly vloženy do lentivirového vektoru pLKO.1-puro.Antisense sekvence shSLC7A5 jsou následující: Shl (5'-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3'), Sh2 (5'-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3').Protilátky proti SLC7A5 (č. 5347) a tubulinu (č. 2148) byly zakoupeny od společnosti Cell Signaling Technology.Protilátky proti SLC7A5 a tubulinu byly použity v ředění 1:1000 pro analýzu Western blot.
Glykolytický zátěžový test Seahorse XF měří úrovně extracelulární acidifikace (ECAR).V testu byly glukóza, oligomycin A a 2-DG podávány postupně za účelem testování buněčné glykolytické kapacity, jak bylo měřeno ECAR.
Buňky A549 transfekované necílovou kontrolou (NC) a shSLC7A5 (Sh1, Sh2) byly přes noc umístěny na misky o průměru 10 cm.Buněčné metabolity byly extrahovány 1 ml ledově chladného 80% vodného methanolu.Buňky v methanolovém roztoku byly seškrábnuty, shromážděny do nové zkumavky a centrifugovány při 15 000 x g po dobu 15 minut při 4 °C.Odeberte 800 µl supernatantu a vysušte pomocí vysokorychlostního vakuového koncentrátoru.Vysušené pelety metabolitů byly poté analyzovány na hladiny tryptofanu pomocí LC-MS/MS, jak je popsáno výše.Hladiny buněčného NAD(H) v buňkách A549 (NC a shSLC7A5) byly měřeny pomocí kvantitativní kolorimetrické soupravy NAD+/NADH (#K337, BioVision) podle pokynů výrobce.Pro každý vzorek byly měřeny hladiny proteinů, aby se normalizovalo množství metabolitů.
Pro předběžné stanovení velikosti vzorku nebyly použity žádné statistické metody.Předchozí metabolomické studie zaměřené na objev biomarkerů15,18 byly považovány za měřítka pro určení velikosti a ve srovnání s těmito zprávami byl náš vzorek adekvátní.Ze studijní kohorty nebyly vyloučeny žádné vzorky.Vzorky séra byly náhodně rozděleny do skupiny pro objevování (306 případů, 74,6 %) a skupiny pro interní validaci (104 případů, 25,4 %) pro necílené metabolomické studie.Také jsme náhodně vybrali 70 případů z každé skupiny ze souboru objevů pro cílené metabolomické studie.Vyšetřovatelé byli zaslepeni k přiřazení skupin během sběru a analýzy dat LC-MS.Statistické analýzy metabolomických dat a buněčné experimenty jsou popsány v příslušných částech Výsledky, Legendy k obrázkům a Metody.Kvantifikace buněčné aktivity tryptofanu, NADT a glykolytické aktivity byla provedena třikrát nezávisle se stejnými výsledky.
Další informace o designu studie najdete v souhrnu zprávy Natural Portfolio spojeného s tímto článkem.
Nezpracovaná MS data extrahovaných znaků a normalizovaná MS data referenčního séra jsou zobrazena v doplňkových datech 1 a doplňkových datech 2, v daném pořadí.Špičkové anotace pro rozdílové funkce jsou uvedeny v doplňkových datech 3. Soubor dat LUAD TCGA lze stáhnout z https://portal.gdc.cancer.gov/.Vstupní data pro vykreslení grafu jsou uvedena ve zdrojových datech.Zdrojová data jsou poskytnuta pro tento článek.
National Lung Screening Study Group atd. Snížení úmrtnosti na rakovinu plic pomocí nízkodávkové počítačové tomografie.Severní Anglie.J. Med.365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR a Prophet, PC Screening rakoviny plic pomocí nízkodávkovaného helikálního CT: výsledky z National Lung Screening Study (NLST).J. Med.Obrazovka 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, a kol.Snížení mortality na rakovinu plic pomocí volumetrického CT screeningu v randomizované studii.Severní Anglie.J. Med.382, 503–513 (2020).
Čas odeslání: 18. září 2023