CRISPR) je technika editace genomu třetí generace: CRISPR způsobil revoluci ve světě

CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repetice) je technika editace genomu třetí generace, která díky svým vysoce výkonným výsledkům způsobila revoluci ve světě. Používá se k léčbě různých biologických onemocnění a infekcí. Různé bakterie a další prokaryota (například archea) mají také systémy CRISPR/Cas9 k obraně proti fágům. Bylo hlášeno, že strategie založené na CRISPR/Cas9 mohou inhibovat růst a progresi trojitě negativního karcinomu prsu (TNBC) cílením na potenciálně pozměněné geny rezistence, transkripci a epigenetickou regulaci. Tyto terapeutické intervence mohou pomoci řešit náročné problémy, jako je rezistence na léky pozorovaná i u TNBC. V současné době se k dodávání CRISPR/Cas9 do cílových buněk používají různé metody, jako jsou fyzikální (mikroinjekce, elektroporace a hydrodynamické režimy), virové (adeno-asociovaný virus a lentivirus) a nevirové (liposomy a lipidové nanočástice). Přestože byly vyvinuty různé modely pro studium molekulárních příčin TNBC, nedostatek citlivých a cílených metod pro poskytování nástrojů pro editaci genomu in vivo omezuje jejich klinické využití. Stručně řečeno, tato recenze komplexně zkoumá pokrok, výzvy, omezení a perspektivy léčby TNBC pomocí CRISPR/Cas9 na základě stávajících důkazů. Zdůrazňujeme také, jak může kombinace umělé inteligence a strojového učení zlepšit strategie CRISPR/Cas9 v léčbě TNBC.
Rakovina je charakterizována nekontrolovaným dělením buněk, narušením kontrolních bodů buněčného cyklu a mutacemi v tumor supresorových genech (TSG) (Matthews a kol., 2022). Mezi různými typy rakoviny je rakovina prsu nejčastějším typem rakoviny u žen a má celosvětově vysokou úmrtnost (Waks a Winer, 2019). Rakovina prsu je heterogenní onemocnění s rozmanitými charakteristikami, jako jsou histologické a biologické rysy, klinický obraz a chování a reakce na léčbu (Weigelt a kol., 2010). Klasifikace rakoviny prsu poskytuje přesné informace o diagnostice rakoviny prsu a prognóze nádoru. Hlavním kritériem pro klasifikaci rakoviny prsu je použití běžných biomarkerů a klinicko-patologických znaků (Tsang a Tse, 2019). Prognózu a reakci na léčbu rakoviny prsu ovlivňuje řada faktorů, včetně přítomnosti estrogenového receptoru (ER), progesteronového receptoru (PR), receptoru 2 lidského epidermálního růstového faktoru (HER2/neu) a histologického stupně, typu a stupně nádoru, velikosti a metastáz do lymfatických uzlin (Al-Tubaiti, 2020). Bylo identifikováno pět vnitřních molekulárních podtypů rakoviny prsu, včetně luminálního A, luminálního B, obohaceného HER2, bazálního typu a nízkoclaudinového typu (Prat et al., 2015). TNBC je molekulární podtyp rakoviny, který neexprimuje všechny ER, PR a HER2 (Yin et al., 2020). Tyto patologické rysy jsou spojeny s TNBC, což potvrzuje její rychlou progresi a agresivnější povahu než jakýkoli jiný typ rakoviny prsu (Feng et al., 2018). Peru et al. (2000) navíc použili technologii microarray k reklasifikaci rakoviny prsu a identifikaci pěti vnitřních podtypů rakoviny prsu (Cadenas, 2012). Bazální typ rakoviny prsu je podtyp rakoviny prsu, který má trojitě negativní fenotyp a je spojen s rychlou progresí. Je třeba poznamenat, že všechny bazální typy rakoviny prsu jsou běžně chybně diagnostikovány jako TNBC, ale pouze 77 % z nich jsou TNBC; Naproti tomu 71–91 % TNBC je bazálních, což naznačuje, že se tyto dva typy rakoviny prsu překrývají a představují různé klasifikace (Wang D.-Y. et al., 2019). To vytváří potřebu charakterizovat heterogenitu TNBC pro objasnění prognózy a identifikaci potenciálních odpovědí na současnou a budoucí léčbu. TNBC navíc představuje 15–20 % všech případů rakoviny prsu a je častější u žen mladších 50 let. Mutace BRCA1 nebo BRCA2 byly hlášeny přibližně u 20 % případů TNBC (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017). Studie také ukázaly, že TNBC má odlišné imunitní mikroprostředí, které zahrnuje vysoké hladiny vaskulárních endoteliálních růstových faktorů, makrofágů asociovaných s nádorem (TAM), lymfocytů infiltrujících nádor (TIL) a dalších molekul zapojených do růstu a migrace nádoru. Proto je pochopení mikroprostředí TNBC klíčové pro její prognózu a léčbu (Fan a He, 2022).
Pro posouzení prognózy TNBC a zajištění účinné léčby je důležitá přesná diagnóza, založená především na imunohistochemii (IHC) k detekci ER, PR a HER2 a mamografii k detekci nádorů prsu. Mamografie však nedokáže adekvátně zobrazit intratumorální rysy, jako je nekróza a fibróza (Deepak Singh a kol., 2021). Vzhledem k tomu, že špatná prognóza a diagnóza brání lékařům v předepisování správných léků (Chaudhary, 2020), používají se různé strategie ke zlepšení péče o pacientky s TNBC. V současné době se u pacientek s TNBC používají dva léky, doxorubicin a cyklofosfamid, které vykazují dobré výsledky. Kromě toho se používají i další platinové léky, jako je karboplatina a cisplatina (Sikov a kol., 2015). Kromě toho se jako potenciální chemoterapeutické léky pro léčbu TNBC používají inhibitory PARP, jako je Olaparib, Velaparib a PF-01367338 (Ishino a kol., 2018). Vzhledem k tomu, že signální dráhy Wnt/b-Catenin, NOTCH a Hedgehog se podílejí na výskytu a progresi TNBC, může být cílená léčba těchto drah důležitou strategií (Aysola et al., 2013). Přestože chirurgický zákrok, radioterapie a chemoterapie zůstávají v současnosti základem léčby TNBC, bylo dosaženo významného pokroku ve vývoji nových léčebných postupů, včetně cílené terapie, imunoterapie a různých nástrojů pro genovou editaci souvisejících s CRISPR, jako jsou Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12, prime editace a genová terapie zaměřená na CRISPR/Cas9. Zde se zaměříme na různé nástroje pro genovou editaci související s CRISPR používané při léčbě TNBC. Mezi nimi se CRISPR/Cas9 těší velké pozornosti.
Cas9n, také známý jako Cas9 nikáza, je geneticky modifikovaná varianta proteinu Cas9 odvozená ze systému editace genomu CRISPR/Cas9 (Gupta et al., 2019). Ve své původní formě obsahuje protein Cas9 dvě nukleázové domény: RuvC a HNH, jejichž hlavní funkcí je štěpení obou řetězců DNA. V Cas9n je však jedna z nukleázových domén, HNH, geneticky mutovaná a stává se neaktivní. Doména HNH proteinu Cas9n proto zůstává nefunkční. Aktivní zůstává pouze doména RuvC, což umožňuje proteinu Cas9n štěpit nebo vytvářet zlomy na jednotlivých řetězcích DNA (Trevino a Zhang, 2014). Ve srovnání s Cas9 dokáže Cas9n účinně snižovat nežádoucí účinky a přesně zlepšovat mechanismy opravy buněk. Cas9n lze použít k řešení různých problémů, jako je vytváření zlomů na specifických místech v dvouvláknové DNA. Za tímto účelem byly dvě molekuly Cas9n zkombinovány a použity společně (Yee, 2016). Kináza smíšené linie 3 (MLK3) je mitogenem aktivovaná proteinkináza, která slouží jako klíčový regulátor během metastázování TNBC (Cronan et al., 2012).
MLK3 může aktivovat více signálních drah vedoucích k metastázám TNBC. Například dráha c-Jun N-terminální kinázy (JNK) reguluje motilitu buněk a degradaci extracelulární matrix a MLK3 aktivuje dráhu JNK, čímž zvyšuje motilitu buněk a propůjčuje invazivní vlastnosti (Rattanasinchai a Gallo, 2016). MLK3 také reguluje EMT. Za tímto účelem aktivuje downstream transkripční faktory, jako jsou Snail, Slug a Twist. Tyto faktory inhibují expresi epiteliálních markerů a podporují expresi mezenchymálních markerů, což vede k získání metastatického fenotypu (Casalino et al., 2023). Bylo pozorováno, že MLK3 hraje roli v remodelaci ECM a aktivaci proteáz, jako jsou matrixové metaloproteinázy (MMP), které degradují ECM. To usnadňuje invazi nádorových buněk a jejich šíření do vzdálených míst (Katari et al., 2019). Předchozí studie tedy ukázaly, že MLK3 hraje klíčovou roli v TNBC. Rattanasinchai a Gallo použili modely TNBC ke studiu role MLK3 a zjistili, že podporuje rozvoj rakoviny prostřednictvím specifických signálních drah. K editaci MLK3 použili CRISPR/Cas9n a pozorovali významné snížení metastáz TNBC (Rattanasinchai a Gallo, 2016).
dCas9, často nazývaný inaktivní Cas9, je modifikovaná derivátová forma proteinu Cas9. Na rozdíl od aktivního Cas9 postrádá dCas9 endonukleázovou aktivitu, takže není schopen indukovat dvouřetězcové zlomy DNA. Proto lze dCas9 použít k přesnému cílení na specifické oblasti genomu bez jakýchkoli změn nebo modifikací sekvence DNA (Wang et al., 2016). V dCas9 jsou dva endonukleázové proteiny, RuvC a HNH, inaktivovány potlačením důležitých aminokyselinových zbytků. (Richter et al., 2016). Navzdory absenci aktivity štěpení DNA hraje dCas9 řadu důležitých rolí v genetickém výzkumu a biotechnologii. Například umožňuje vizualizaci specifických oblastí genomu, usnadňuje regulaci transkripce a podporuje epigenetické modifikace (Brocken et al., 2018).
Transkripční faktor ZEB1 (zinc finger E-box binding homeobox 1) hraje specifickou a klíčovou roli v mediaci epiteliálně-mezenchymální transformace (EMT), buněčného procesu, ke kterému dochází během embryonálního vývoje, opravy tkání a progrese rakoviny. Zahrnuje transformaci epiteliálních buněk na mezenchymální buňky, což vede ke změnám v buněčné morfologii, motilitě, invazivitě atd. (Wu et al., 2020). ZEB1 inhibuje řadu epiteliálních markerů, jako je E-kadherin a okludin, které jsou zodpovědné za udržování buněčné adheze a polarity epiteliálních buněk u TNBC (Moreno-Bueno et al., 2008). Kromě toho ZEB1 aktivuje určité markery, jako je N-kadherin, vimentin a fibronektin (Konradi et al., 2014), a také reguluje geny zapojené do remodelace cytoskeletu, jako jsou Rho GTPázy a matrixové metaloproteinázy (MMP) (Huang et al., 2014). 2022), kromě toho ovlivňuje také různé signální dráhy, jako je transformující růstový faktor-β (TGF-β), Wnt signalizace atd., čímž podporuje invazi a metastázování nádoru u TNBC (Chen et al., 2016). Četné studie a vědecké důkazy naznačují, že ZEB1 má velký potenciál jako cenné činidlo pro detekci a terapeutickou intervenci TNBC. V nedávné studii Waryah et al. použili model TNBC a dosáhli úplné suprese ZEB1 pomocí dCas9. Pozorovali tak velmi vysokou specificitu a téměř úplnou inhibici ZEB1 v podmínkách in vivo (Waryah et al., 2023).
CRISPR/Cas12 je nástroj pro editaci genů s názvem CRISPR/Cpf1. Je odvozen od systému CRISPR/Cas, kde termín Cas12 označuje protein 12 asociovaný s CRISPR (Bharathkumar et al., 2022), který je zcela podobný Cas9. Jediný rozdíl je v tom, že obsahuje protein Cas12. Ve srovnání s Cas9 má Cas12 některé jedinečné funkce, jako je generování lepkavých konců během procesu editace genů, zatímco Cas9 generuje tupé konce (Wang et al., 2021). Tato vlastnost Cas12 přispívá k jeho specifické technologii manipulace s DNA. Jako protein schopný přesně rozpoznávat a štěpit cílovou DNA má mimořádnou všestrannost, což z něj činí účinný nástroj pro řadu aplikací, včetně editace genů (Pickar-Oliver a Gersbach, 2019).
Podobně jako jiné varianty CRISPR je i CRISPR/Cas12 schopen vyřadit nebo aktivovat geny v TNBC a zaměřit se na geny, které hrají důležitou roli v jeho patogenezi nebo reakci na léčbu (Yang a Zhang, 2023). K dosažení tohoto procesu byla vyvinuta vodicí RNA (gRNA), která směruje Cas12 k cílovému genu. Jakmile se Cas12 naváže na svůj cíl, zavede dvouřetězcové zlomy v DNA a aktivuje mechanismy opravy DNA. Během procesu opravy mohou být začleněny nesprávné nukleotidy, což vede k genovým mutacím a ztrátě funkce (Zhang a kol., 2021a). Kromě toho byla k aktivaci genů použita také vylepšená verze enzymu Cas12 (nazývaná dCas12). Její kombinací s transkripčním aktivátorem je možné indukovat určité geny, a tím je aktivovat. Tato technologie má velký potenciál v podpoře aktivace genů supresorů nádorů (Sultan a kol., 2022).
Prime editace je nově vyvinutá a extrémně pokročilá technologie editace genomu. Je schopna velmi přesně modifikovat DNA organismu (Chen a Liu, 2023). Prime editace se dosahuje integrací dvou hlavních složek: modifikovaného enzymu CRISPR/Cas9 a reverzní transkriptázy. Úlohou enzymu CRISPR/Cas9 je selektivně cílit na přesná místa v genomu, zatímco reverzní transkriptáza pomáhá důkladně modifikovat DNA v cílovém místě (Hassan et al., 2021). V mechanismu editace primerů zahrnuje první krok vytvoření RNA pro editaci primerů (pegRNA) (Standage-Beier et al., 2021). Obsahuje cílovou sekvenci a templát RNA odpovídající požadovanému místu editace v cílové DNA. PegRNA je poté zavedena do cílových buněk spolu s nukleázou pro editaci primerů (PE2). PE2 je fúzní protein sestávající z enzymu Cas9, reverzní transkriptázy a adaptéru pro editaci primerů (Martín-Alonso et al., 2021). Uvnitř buňky komplexy pegRNA a PE2 hledají specifickou DNA, kterou chtějí modifikovat. Enzym Cas9 štěpí DNA a vytváří templát sestávající z jednotlivých řetězců (Choi et al., 2022). Reverzní transkriptáza používá tento templát k přípravě DNA k editaci. Spolu s kopírováním DNA jsou zahrnuty i instrukce pro editaci templátu RNA. Nakonec se nově vytvořený řetězec DNA použije jako templát k opravě zlomu v DNA, což vede ke změněné sekvenci DNA obsahující požadovanou modifikaci (Ochoa-Sanchez et al., 2021). Mechanismy editace primerů mohou vést k rozsáhlým mutacím v genech. Mohou cílit na bodové mutace, inzerce, delece a dokonce i genové náhrady (Anzalone et al., 2019; Chen a Liu, 2023). Prime editace nabízí oproti předchozím technologiím editace genomu několik výhod. Patří mezi ně zvýšená přesnost, snížené účinky mimo cíl a schopnost editovat DNA bez spoléhání se na dvouřetězcové zlomy DNA (Anzalone et al., 2020).
Technologie CRISPR/Cas9 byla původně vyvinuta k ochraně bakterií před přenosem plazmidů a fágovou infekcí a později byla znovu využita jako účinný nástroj pro cílení DNA na bázi RNA pro editaci genomu (Jiang a Doudna, 2017). Kromě toho bylo hlášeno, že systém CRISPR/Cas9 je přítomen v 50 %, respektive 87 % bakteriálních a archaeálních genomů (Ishino a kol., 2018). CRISPR/Cas9 je potenciálním nástrojem pro deleci, inzerci a korekci jakékoli abnormální genetické sekvence za použití in vivo a in vitro metod (Sabit a kol., 2021). Navíc se ukázalo, že CRISPR/Cas9 je součástí adaptivního imunitního systému díky své specificitě pro cílové geny (Chen a Zhang, 2018).
CRISPR/Cas9 se skládá z Cas9 a jediné vodicí RNA (sgRNA). Cas9 je endonukleáza složená z několika proteinových složek. Cas9 má navíc jedinečné strukturní a konformační vlastnosti (Pacesa et al., 2022), protože se skládá ze dvou laloků: rozpoznávacího (REC) a nukleázového (NUC). Lalok REC je dále rozdělen do tří oblastí: REC1, REC2 a můstkových helixů (Cromwell et al., 2018). NUC se skládá ze tří laloků, a to RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH a interakční domény protospacer adjacent motif (PAM) (obr. 1) (Song et al., 2016). sgRNA se skládá ze dvou složek, včetně CRISPR RNA (crRNA) a transkódující malé RNA (tracer RNA) (obrázek 1). SgRNA spojuje protein Cas9 s konexiny a vytváří aktivní komplex, známý také jako efektorový komplex (Richter et al., 2012). crRNA je 18–20 nukleotidový pár bází, který hraje klíčovou roli v rozpoznávání cílových sekvencí DNA. Kromě toho se crRNA páruje s cílovou DNA a tracrRNA funguje jako scaffold pro nukleázu Cas9, která se váže na cílovou DNA (Manghwar et al., 2019). Na druhou stranu, sekvence PAM má 3 nukleotidy, což potvrzuje, specifikuje a zprostředkovává vazbu efektorového komplexu na DNA. Podjednotky RuvC a HNH proteinového komplexu Cas9 mají katalytickou aktivitu (Richter et al., 2012; Asmamaw a Zawdie, 2021). Nukleázová doména HNH podjednotky Cas9 štěpí řetězec DNA spojený s crRNA. Nukleázová doména RuvC štěpí jiné řetězce DNA a generuje dvouřetězcové zlomy (DSB), načež se aktivují dva různé mechanismy opravy zlomů DNA (Jiang a Doudna, 2017) (obrázek 1).
Obrázek 1. Přehled CRISPR/Cas9 (A). Komponenty systému CRISPR/Cas9: (i). Endonukleáza Cas9 je zodpovědná za štěpení cílové sekvence DNA, (ii) jediná vodicí (sg) RNA, která vzniká fúzí chimér crRNA a tra-crRNA. (dvě). Cas9 zahrnuje několik komponent, jako je Rec I, Rec II, NUC lalok (HNH a Ruv C jsou subkomponenty) a interakční doména PAM (C) s odpovídajícími funkcemi. Proteinový komplex CRISPR/Cas9 štěpí sekvence DNA na nekomplementární a komplementární formy (D). CRISPR/Cas9 edituje genom ve třech fázích: rozpoznání, štěpení a oprava. Navržená sg-RNA vede Cas9 a rozpoznává požadovanou sekvenci prostřednictvím komplementární komponenty crRNA. Cas9 rozpoznává sekvenci PAM na 5'-NGG-3' a taví DNA, čímž vytváří hybrid DNA-RNA a aktivuje štěpení. Doména HNH genu Cas9 štěpí komplementární řetězec a doména RuvC štěpí nekomplementární řetězec. CRISPR/Cas9 opravuje dvouvláknovou DNA (dsDNA) jejím rozštěpením dvěma způsoby: spojováním nehomologních konců (NHEJ) a homologií řízenou opravou (HDR). NHEJ opravuje dvouvláknovou DNA v nepřítomnosti cizí homologní DNA enzymatickým procesem, což je mechanismus náchylný k chybám, který dokáže vkládat nebo odstraňovat náhodné sekvence DNA. HDR je velmi specifická a vyžaduje homologní DNA templáty.
Opravné dráhy zprostředkované CRISPR/Cas9 zahrnují mechanismy nehomologního spojování konců (NHEJ) a homologicky řízené opravy (HDR). NHEJ je dráha náchylná k chybám, protože zahrnuje inzerci nebo deleci a nevyžaduje žádný vzorec během opravného mechanismu. Používá náhodné nukleotidy k vytvoření standardních proteinů (Abbasi et al., 2021). Tento opravný systém se skládá ze čtyř komplexů, jako je komplex KU, křížově komplementující proteinový komplex typu 4 (XRCC-4), enzym pro zpracování konců DNA a proteinkináza DNA-PKcs (Abbasi et al., 2021). Protein komplexu KU má dvě podjednotky, Ku 70 a Ku 80, a hraje důležitou roli v mechanismu NHEJ, protože mechanismus opravy je iniciován vazbou dvou podjednotek (Ku 70 a Ku 80) na tupé nebo téměř tupé konce cílové DNA (Abbasi et al., 2021), které slouží jako scaffold pro nábor dalších faktorů souvisejících s NHEJ do místa poškození (Yang et al., 2020). XRCC-4 a DNA ligáza se skládají z 334, respektive 911 aminokyselin a komplex XRCC4-DNA ligáza IV stimuluje ligaci konců DNA (Chatterjee et al., 2015). Enzym pro zpracování konců DNA, známý také jako polynukleotidkináza 3'-fosfát, je enzym pro zpracování konců DNA. Během opravy DSB dokáže odstranit 3'P skupinu v DNA a fosforylovat 5'OH skupinu. Zahrnuje také opravu jednořetězcových zlomů (SSB) pomocí opravné dráhy SSB (Chatterjee et al., 2015). Proteinová kináza DNA-PKcs je DNA-dependentní proteinkináza, která se skládá z katalytické podjednotky kináz souvisejících s fosfatidylinositol-3-kinázou (PIKK) a rodiny ataxia telangiectasia mutated (ATM), stejně jako z ATR souvisejících s ATM a Rad3, zlomů řetězce (DSB) a jednořetězcových zlomů (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
HDR je přesnější a vhodnější opravný mechanismus, protože informace se kopíruje pomocí intaktní formy homologního duplexu DNA, ačkoli to vyžaduje přítomnost sesterských chromatid. K tomu dochází během fáze S/G2 buněčného cyklu savců. HDR se vyskytuje hlavně u kvasinek, ale NHEJ je kritická u savců (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). Kompletní opravný mechanismus je znázorněn na obrázku 1.
Vzhledem k tomu, že TNBC je způsobena genetickými a epigenetickými abnormalitami, může být korekce maligních genomických/epigenomických abnormalit pomocí CRISPR/Cas9 rozumným terapeutickým přístupem (Chen et al., 2019). Kromě toho některé transkripční faktory zapojené do buněčně specifické transkripční regulace mohou vykazovat jedinečné vlastnosti rakovinných buněk, což naznačuje, že transkripční regulace může být vynikajícím přístupem k léčbě rakoviny (Drost et al., 2017). Využití těchto molekulárních vlastností nádorů, jako jsou genetické, epigenetické a transkripční defekty, pro vývoj léčiv může zlepšit klinické výsledky a snížit náklady na screening. CRISPR je potenciální nástroj pro editaci genů, který dokáže nejen detekovat a identifikovat genomové cíle způsobující rakovinu, ale lze jej také použít k editaci, potlačení a epigenetické modifikaci onkogenů v lidských buňkách (tabulka 1) (Ahmed et al., 2021). Bylo provedeno několik screeningů CRISPR za účelem hledání genů spojených s tumor supresory, onkogeny a rezistencí na léky. Použití CRISPR/Cas9 k editaci různých onkogenů TNBC je znázorněno na obrázku 2.
Obrázek 2. Genová editace různých onkogenů TNBC pomocí CRISPR/Cas9, která vede ke snížení růstu nádoru a metastáz. Mezi tyto onkogeny patří CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 a CXCR7, Crypto1, ROR1 a ST8SIA, které se podílejí na výskytu a metastázování TNBC.
Migrace, invaze a epiteliálně-mezenchymální přechod (EMT) rakovinných buněk jsou spojeny s ITGA9. Předchozí studie ukázaly, že ITGA9 hraje klíčovou roli v metastázách Notch buněk a hraje zajímavou roli v metastázování rabdomyosarkomu (Molist a kol., 2020). Kromě toho bylo zjištěno, že ITGA9 úzce souvisí s prognózou pacientek u několika typů nádorů, včetně rakoviny prsu (Wang Z. a kol., 2019). Bioinformatická analýza ITGA9 navíc ukázala, že jeho exprese v TNBC byla významně vyšší než u jiných podtypů rakoviny prsu. Zvýšené hladiny ITGA9 jsou spojeny s metastázami a relapsy nádoru u pacientek s TNBC. Vyřazení ITGA9 pomocí CRISPR/Cas9 vedlo k vlastnostem podobným rakovinným kmenovým buňkám (CSC), angiogenezi nádoru, růstu nádoru a snížení metastáz podporou degradace β-kateninu v TNBC (Wang Z. a kol., 2019).
Crypto-1 je členem rodiny TGF-β a je klíčový pro časnou embryogenezi, udržování kmenových buněk a metastázy rakoviny (Ishii et al., 2021). Také známý jako Tdgf-1, je to onkogenní signální protein ukotvený v GPI, který se podílí na regulaci tvorby primitivního pruhu, mezodermu a endodermu, stejně jako na vzniku levo/pravé asymetrie ve vývoji tělesných orgánů během embryogeneze (Zhang et al., 2021b). Kromě toho bylo prokázáno, že Cripto-1 se podílí na epiteliálně-mezenchymální přechodu (EMT) jako marker kmenových buněk (Zhang et al., 2021b). EMT je klíčový nejen pro různé procesy, jako je embryonální vývoj, fibróza a hojení ran, ale také pro invazi a metastázy rakoviny. Kromě toho bylo prokázáno, že Cripto-1 interaguje se čtyřmi receptory Notch a zvyšuje jejich posttranslační zrání (Brandstadter a Maillard, 2019). Je známo, že signální dráha Notch se podílí na udržování lidských buněk rakoviny prsu. Studie ukázaly, že knockout genu Crypto-1 zprostředkovaný CRISPR/Cas9 potlačuje růst a metastázování rakoviny. Crypto-1 se proto může stát důležitým terapeutickým cílem pro TNBC (Castro et al., 2015).
Protein XCL12 a jeho chemokinový receptor CXC (CXCR4 a CXCR7) hrají různé role v proliferaci, růstu, migraci a invazi rakovinných buněk (Wu et al., 2015). Tyto chemoreceptory byly spojovány s rozvojem TNBC prostřednictvím mnoha signálních drah v modelech in vivo i in vitro (Wu et al., 2015). Aktivace CXCR4 a CXCR7 je navíc spojena s větší náchylností k metastázám a špatnou prognózou u TNBC (Karn et al., 2022). Proto se knockout genů CXCR4 a CXCR7 může stát účinnými cílovými geny pro léčbu rakoviny prsu, včetně TNBC. Studie Yang et al. Yang et al. (2019) použili CRISPR/Cas9 ke společnému knockoutu genů CXCR4 a CXCR7 a zjistili, že proliferace, růst, migrace a invaze TNBC byly významně inhibovány (Yang et al., 2019).
Zvýšené hladiny miR-3662, onkogenu TNBC, byly pozorovány v tkáních rakoviny prsu (Yi et al., 2022). Bylo prokázáno, že knockdown miR-3662 inhibuje růst a metastázy nádoru prsu jak in vivo, tak in vitro (Agarwal a Gupta, 2021). HBP-1 je silný inhibitor signalizace Wnt/-kateninu a je pravděpodobně zodpovědný za růst buněk TNBC zprostředkovaný miR-3662. Nedávno Yi et al. zjistili, že osa miR-3662-HBP1 reguluje signální dráhu Wnt/-kateninu v buňkách TNBC (Yi et al., 2022). Vzhledem ke své nádorově specifické expresi může být miR-3662 potenciálním terapeutickým cílem pro TNBC. Knockdown miR-3662 zprostředkovaný CRISPR/Cas9 tedy může být vynikajícím přístupem k vývoji nových léků pro léčbu TNBC.
UBR5 je nukleofosfoprotein o hmotnosti 300 kDa, který byl identifikován jako klíčový regulátor tumorigeneze, metastáz a imunitní odpovědi u různých druhů rakoviny (Shearer a kol., 2015; Fu a kol., 2023). Bylo popsáno, že UBR5 je ve vzorcích TNBC vysoce upregulován a stimuluje funkci ERα indukcí proliferace prostřednictvím své ubikvitin ligázové aktivity (Bolt a kol., 2015). Studie sekvenování celého exomu primárních vzorků TNBC také ukázaly zvýšenou expresi UBR5, což naznačuje jeho roli ve vývoji TNBC. Navíc delece UBR5 řízená CRISPR/Cas9 prokázala významnou inhibici metastáz a růstu TNBC v experimentálních myších modelech. Navíc zahrnutí UBR5 do myšího modelu divokého typu obnovilo jeho plnou funkčnost, zatímco tento účinek nebyl pozorován u inaktivovaných mutantních kmenů (Liao a kol., 2017). Nedostatek UBR5 je spojen se zvýšenou apoptózou, nekrózou a inhibicí růstu nádoru u TNBC v důsledku špatné angiogeneze. V důsledku ztráty UBR5 je sníženo šíření nádoru do vzdálených orgánů a UBR5 indukuje abnormální EMT, zejména snížením exprese E-kadherinu (Zhang a Weinberg, 2018). Nedávno se ukázalo, že UBR5 je velmi důležitým faktorem v transkripci PDL1 indukované IFN-γ u TNBC kvůli jeho chybějící ubikvitinační aktivitě E3. Analýza RNA transkriptomu ukázala, že UBR5 může mít systémové účinky na geny spojené s dráhou IFN-γ a podporovat transaktivaci PDL1 zvýšením hladin aktivace proteinkinázy RNA (PKR) a jejích signálních převodníků a aktivátorů, transkripce 1 (STAT1) a regulačního faktoru interferonu 1 (IRF1). Kombinovaná ablace exprese UBR5 a PD-L1 zprostředkovaná CRISPR/Cas9 však má synergický terapeutický účinek než samotná blokáda s výraznými účinky na mikroprostředí nádoru (Wu et al., 2022). CRISPR/Cas9 tak může být důležitým nástrojem pro inhibici funkce UBR5, a tím potlačení metastáz TNBC a růstu nádoru.
ROR1 je transmembránový protein typu I, který je exprimován během rakoviny a embryonálního vývoje a byl identifikován jako onkofetální protein (Nicholas Borcherding, 2014). Invazivní chování různých lidských druhů rakoviny je spojeno se zvýšenou regulací ROR1. Slibné výsledky byly získány ze studií in vivo a in vitro zahrnujících terapeutické sloučeniny cílící na ROR1 (Chien et al., 2016). Zvýšené hladiny mRNA ROR1 v biopsiích prsní tkáně byly také spojeny s agresivními bazálními nádory prsu (BL) a jejich migrací do jiných částí těla. Nadměrná exprese ROR1 byla navíc identifikována jako prognostický marker pro rozvoj TNBC (Chien et al., 2016). Účinnou strategií by však bylo umlčení ROR1 pomocí CRISPR/Cas9 k potlačení růstu a metastáz TNBC.
Proces sialylace zahrnuje adici kyseliny sialové na glykokonjugáty, která je katalyzována sialyltransferázami (ST). ST8SIA1 patří do rodiny ST a hraje důležitou roli v patogenezi různých onemocnění, jako je lymfocytární leukémie a kolorektální karcinom (Chang et al., 2018). Analýza RNA sekvence ukazuje, že ST8SIA1 je vysoce exprimován v prsní tkáni pacientek s TNBC a pozitivně koreluje s mutacemi v genu pro supresor tumoru p53, což může přispívat k patogenezi TNBC (Battula et al., 2017). Kromě toho se ST8SIA1 podílí na metastázování a recidivě TNBC, což naznačuje, že hraje důležitou roli ve výskytu a rozvoji TNBC. V in vitro modelu TNBC bylo prokázáno, že knockdown ST8SIA1 pomocí CRIPSR/Cas9 blokuje růst a metastázování (Battula et al., 2017). To naznačuje, že CRISPR/Cas9 může být důležitým nástrojem pro inhibici funkce onkogenu ST8SIA1 při léčbě TNBC.
NAT1 je metabolický enzym, který katalyzuje tvorbu xenobiotických sloučenin fáze II a je exprimován téměř ve všech lidských tkáních. NAT1 může využít kofaktor folát k cílení na acetyl-CoA (acetyl-CoA) i v nepřítomnosti aromatického aminu jako substrátu (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). Studie ukázaly, že NAT1 reguluje funkci matrixové metaloproteinázy 9 (MMP9) v modelech buněk rakoviny prsu a chrání před reaktivními formami kyslíku (ROS) během glukózového hladovění (Wang et al., 2018). Bylo prokázáno, že delece NAT1 inhibuje komplex pyruvátdehydrogenázy, což vede k mitochondriální dysfunkci (Wang L. et al., 2019). Různé další zprávy navíc ukázaly, že inhibice NAT1 pomocí malých molekul a umlčování siRNA může snížit invazivitu a proliferaci buněk rakoviny prsu (Stepp et al., 2018). Nedávno byl CRISPR/Cas9 použit k potlačení NAT1 v buněčné linii rakoviny prsu MDA-MB-231, což ovlivňuje buněčný metabolismus v závislosti na úrovni jeho exprese. Tato studie také ukázala, že NAT-1 je klíčový pro progresi a metastázování TNBC (Carlisle et al., 2020).
Koordinovaná transkripce onkogenů je regulována superenhancery, transkripčními faktory a kofaktory (Hnisz et al., 2015). Kromě toho je pro regulaci transkripce nezbytná skupina cyklin-dependentních kináz (CDK), jako jsou CDK7, CDK8, CDK9, CDK12 a CDK13. Z nich se CDK7 podílí na fosforylaci RNA polymerázy II, která je velmi důležitá pro zahájení a expanzi transkripce onkogenů v patogenezi TNBC. V zásadní studii inhibovala delece CDK7 pomocí CRISPR/Cas9 TNBC, což naznačuje, že patogeneze TNBC je závislá na CDK7 (Wang Y. et al., 2015).
Studie ukázaly, že mutace v MYC a RBP (protein vázající RNA) mohou vést k apoptóze, zatímco mutace jednotlivých genů v MYC nebo RBP neovlivňují růst rakovinných buněk (Einstein et al., 2021). Více než 1000 RBP v lidském genomu bylo testováno pomocí knihovny založené na CRISPR/Cas9. Z nich bylo 57 RBP shledáno kritickými pro růst rakovinných buněk s vysoce zvýšenými hladinami MYC (Wheeler et al., 2020). Kromě toho je YTHDF2 důležitý pro udržení růstu buněk TNBC a snižuje množství methylovaných transkriptů během transkripce a translace na vysoké úrovni v rakovinných buňkách s vyšší expresí MYC. YTHDF2 navíc není nezbytný pro rakovinné buňky, které jsou méně závislé na zvýšených hladinách MYC pro prodloužení přežití pacientů s TNBC (Einstein et al., 2021), což naznačuje, že by mohl být potenciálním terapeutickým cílem pro léky, které mohou překonat TNBC.
Proteiny zinkových prstů (ZNF) tvoří přibližně 1 % celkového lidského genomu. Studie ukázaly, že ZNF může regulovat proliferaci buněk u různých druhů rakoviny, jako je rakovina jater, rakovina prsu a kolorektální karcinom (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). Knihovny generované knockoutem CRISPR byly použity ke screeningu různých tumor supresorových genů (TSG) v buňkách rakoviny prsu (Shalem et al., 2014). Od té doby transkriptomická studie buněk rakoviny prsu s delecí ZNF319 v genu CRISPR/Cas9 ukázala, že ZNF319 je tumor supresorový gen, který snižuje proliferaci rakoviny prsu, a proto se podílí na různých potenciálních signálních mechanismech a dalších biologických funkcích (Wang L. et al., 2022).
Feroptóza je typ programované buněčné smrti, která je závislá na přítomnosti železa. Je známo, že rozvoj feroptózy je ovlivněn přítomností lipidových peroxidů. Kromě toho bylo hlášeno, že PKCβII vykazuje časnou lipidovou peroxidaci a zvýšená lipidová peroxidace je spojena s feroptózou. Screening knihovny inhibitorů kináz zprostředkovaných CRISPR/Cas9 ukázal, že PKCβII se podílí na procesu lipidové peroxidace, která je klíčová pro feroptózu v buňkách MDA-MB-231 (Zhang et al., 2022). To naznačuje, že knockout PKCβII pomocí CRISPR/Cas9 může být potenciálním cílem tumorového supresorového genu pro léčbu onemocnění souvisejících s feroptózou (Zhang et al., 2022).
Předpokládá se, že léková rezistence je zodpovědná za přibližně 90 % úmrtí u pacientů s rakovinou a je jednou z hlavních výzev v léčbě rakoviny (Bukowski et al., 2020). Výsledky naznačují, že s lékovou rezistencí je spojen dostatečný počet genů souvisejících s efluxem léků, opravou DNA, apoptózou a různými buněčnými signálními dráhami (Haider et al., 2020). Mezi nimi bylo několik genů cílených nástroji CRISPR/Cas9 a vykazovaly slibné výsledky ve snižování lékové rezistence a zvyšování účinnosti protinádorové léčby (Vaghari-Tabari et al., 2022). Kromě toho se ukázalo, že vysoce výkonné knihovny pro screening knockoutů genů CRISPR/Cas9 přispívají k modifikaci funkce potenciálních cílových genů lékové rezistence (Shalem et al., 2015). Pro identifikaci genů rezistence na paklitaxel bylo použito sekvenování RNA spojené se screeningem celogenomové sgRNA knihovny k identifikaci osmi kandidátních genů, včetně histondeacetylázy 9 (HDAC9), které jsou spojeny s lékovou rezistencí u pacientů s rekurentním TNBC (B et al., 2020). V jiné studii byla pozorována zvýšená exprese diserin/threonin a tyrosin proteinkinázy (DSTYK) během přežití pacientů s TNBC léčených protinádorovými léky. Navíc knockdown DSTYK zprostředkovaný CRISPR/Cas9 významně zvýšil apoptózu lékově rezistentních rakovinných buněk in vitro (buňky SUM102PT a buňky MDA-MB-468) a in vivo modelu TNBC (Ogbu et al., 2021).
Přestože TNBC má abnormální aktivaci dráhy MAPK, klinický účinek terapií cílených na MEK je slabý. Screening genomové knihovny CRISPR/Cas9 ukázal, že inhibice PSMG2 (chaperon 2 pro sestavení proteomu) senzibilizuje buňky TNBC BT549 a MB468 na inhibitor MEK AZD6244. Snížení exprese PSMG2 pomocí CRISPR/Cas9 změnilo normální funkci proteazomu, což vedlo k autofagií zprostředkované demontáži PDPK1, čímž se dále zlepšily nádorové buňky v myších modelech TNBC indukované AZD6244 (inhibitor MEK) a MG132 (inhibitor proteazomu). Inhibitory proteazomu a MAP kinázy (MEK) lze tedy podávat synergicky ke snížení proliferace nádorových buněk (Wang X. et al., 2022).
CRISPR/Cas9 byl také použit ke screeningu ztráty genové funkce vedoucí k rezistenci na TNBC (Shu et al., 2020). Ge a kol. vysvětlili mechanismus lékové rezistence rakovinných buněk léčených JQ1, inhibitorem BET bromodomény (BBDI), u TNBC. Pomocí CRISPR/Cas9 zjistili, že delece genu rb1 způsobila, že se TNBC stala rezistentní na protinádorový lék JQ1. Funkce rb1 je proto důležitá v reakci na léky JQ1 u TNBC. Také uvedli, že paklitaxel je inhibitor kinázy/mikrotubulů CDK4/6 a jeho kombinace s BBDI, jako je JQ1, může poskytnout slibné terapeutické odpovědi na lékově rezistentní TNBC (Ge et al., 2020).
Bylo zjištěno, že transkripční krajina dlouhé nekódující RNA (lncRNA) je zodpovědná za rezistenci na neoadjuvantní terapii u TNBC. Tato studie ukazuje, že pět různých transkriptů lncRNA MALAT1 je vysoce exprimováno u TNBC. Navíc delece MALAT1 zprostředkovaná CRISPR/Cas9 zvýšila citlivost buněk TNBC BT-549 na paklitaxel a doxorubicin, což naznačuje potenciální roli rezistence MALAT1 u TNBC (Shaath et al., 2021).
Mutace v genu BRCA1 (BRCA1m) jsou heterogenní, a proto je obtížné je detekovat. Cílení na PARP1 (poly(ADP-ribóza)polymerázu), syntetického letálního partnera genu BRCA1, může zvýšit chemosenzitivitu buněk TNBC na léky. Použitím metody CRISPR/Cas9 zvýšila delece PARP1 citlivost protinádorových léků, jako je doxorubicin, gemcitabin a docetaxel, na buňky TNBC s mutací mBRCA1, což naznačuje, že PARP1 se také podílí na rezistenci na léky u buněk TNBC (Vaghari-Tabari a kol., 2022). Je známo, že mutace v genech tumor supresorů BRCA1 nebo BRCA2 zvyšují pravděpodobnost vzniku rakoviny prsu u lidí. Léčba těchto pacientek vyžaduje použití inhibitorů PARP. Dále bylo prokázáno, že knockout nukleotidového záchranného faktoru DNPH1 pomocí CRISPR/Cas9 může odstranit toxický nukleotid 5-hydroxymethyldeoxyuridin (hmdU) monofosfát, čímž se zvýší citlivost buněk s deficitem BRCA na inhibitory PARP (Fugger a kol., 2021). Inhibitory CRISPR/Cas9 a PARP1 se tedy mohou stát důležitou léčebnou strategií pro TNBC.
Gen penetrantního glykoproteinu (P-gp) je gen rezistence na mnohočetná léčiva, který je obecně upregulován u přibližně 41 % všech TNBC (Sun et al., 2020). Eflux léčiv indukovaný P-gp byl identifikován jako klíčový regulátor rezistence na léčiva u rakoviny prsu. Inhibitory P-gp prokázaly zvýšenou citlivost na protinádorové léky u rakoviny prsu (Famta et al., 2021). Ablace nebo potlačení P-gp a inhibitorů P-gp zprostředkovaná CRISPR/Cas9 tedy může být velmi důležitými metodami k překonání rezistence na léčiva u TNBC.
Je známo, že ATP-vázající kazetový transportér G2 (ABCG2) způsobuje lékovou rezistenci u TNBC (Palasuberniam et al., 2015), ačkoli v současné době neexistují žádné zprávy o vztahu mezi umlčováním CRISPR/Cas9 a ABCG2 a inaktivací genů tumor supresoru. PTEN může zvýšit aktivaci ABCG2 (Palasuberniam et al., 2015), (Deepak Singh et al., 2021). Použití CRISP/Ca9 k odstranění ABCG2 a jeho kombinace s inhibitorem ABCG2 proto může být vhodnou léčbou k překonání lékové rezistence u TNBC. Tabulka 2 uvádí CRISPR/Cas9 cílící na všechny geny rezistence.
Tabulka 2. CRISPR/Cas9 cílí na různé geny rezistence TNBC za účelem senzibilizace buněk na protinádorové léky.
Knihovny CRISPR/Cas9 jsou potenciálními nástroji pro screening genových mutací spojených s patogenezí rakoviny (Chan et al., 2022). Tato screeningová metoda zahrnuje čtyři kroky, jako je (a) konstrukce knihovny, (b) lentivirová transdukce, (c) fenotypový screening a (d) analýza cílového genu. Přestože TNBC má abnormální aktivaci dráhy MAPK, klinická prognóza cílené terapie MEK u pacientů s TNBC nesoucích mutace v tumor supresorových genech, jako jsou PTEN, RB1 a TP53, je velmi špatná.
Kromě toho byl pomocí CRISPR/Cas9 testován screening genových knockoutů s nejúčinnější a nejselektivnější molekulou, dehydrokatrol, který se hojně vyskytuje v guatemalských květových a listových extraktech, aby se pochopil vliv dehydrokatrolu na MDA-MB-231. Mechanismy selektivní buněčné cytotoxicity. Charakteristiky mezenchymální kmenovosti podtypů TNBC. Tento screening založený na CRISPR/Cas9 také odhalil, že HSD17B11, gen kódující 17β-hydroxysteroid dehydrogenázu typu 11, je vysoce exprimován v buňkách MDA-MB-231 a vede k dehydrofalkarinolu specifickému pro buňky MDA-MB-231 (Grant et. al., 2020). To naznačuje, že genomický screening CRISPR/Cas9 má velký potenciál při identifikaci mechanismů, které jsou základem protinádorových vlastností potenciálních přírodních sloučenin.
Kromě toho byla studována zranitelnost TNBC k rakovině pomocí nezaujatého celogenomového in vivo CRISPR/Cas9 screeningu, který prokázal souvislost mezi onkogenními a tumor supresorovými drahami. Bylo zjištěno, že klíčové komponenty drah mTOR a Hippo hrají důležitou roli v regulaci nádorů u TNBC. Studie dále ukázaly, že farmakologická inhibice onkoproteinu mTORC1/2 a YAP účinně inhibuje patogenitu TNBC za použití in vitro modelu synergie léčiva a matrice a in vivo xenograftů odvozených od pacienta. Inhibice mTORC1/2 zprostředkovaná Torinem-1 navíc zvyšuje makropinocytózu, zatímco inhibice YAP indukovaná verteporfinem vede k buněčné smrti TNBC. Celkově vzato tyto výsledky zdůrazňují sílu a robustnost celogenomového in vivo CRISPR screeningu k identifikaci nových a účinných léčebných postupů pro TNBC (Dai et al., 2021).
Dysregulace imunitního systému je důležitým faktorem v tumorigenezi. Rakovinné buňky se vyhýbají imunitnímu odbourávání obcházením obranných mechanismů, včetně narušení aktivity imunitních buněk v nádorovém mikroprostředí a ohrožení imunitního systému. Proto může být vývoj vylepšeného imunitního systému klíčovým přístupem k boji proti nádorům. Použití genové modifikace založené na CRISPR/Cas9 řeší několik problémů souvisejících s imunitní dysfunkcí z různých hledisek. CRISPR/Cas9 se používá ke zlepšení protinádorové imunity proti rakovině prsu prostřednictvím následujících cest (obrázek 3).
Obrázek 3. Imunoterapie CRISPR/Cas9 cílí na buňky TNBC. Ztráta CDK5 a knockdown PDL1 a CD155 posilují imunitní systém. Stejně tak ztráta A2AR a knockdown TAA, jako jsou HER2, mucin 1 a TEM8, zvýšily účinnost CAR-T buněk při usmrcování rakovinných buněk. Screening T buněk řízený CRISPR/Cas9 ukázal, že narušení kinázy p38 zvyšuje protinádorovou aktivitu T buněk. T buňky modifikované CRISPR/Cas9 zvyšují expresi TCR (receptor T buněk), což vede k protinádorové aktivitě T buněk.
Cílem imunoterapie je stimulovat imunitní systém k útoku na rakovinné buňky. Nadměrná exprese imunitních kontrolních proteinů obvykle zabraňuje autoimunitním reakcím, ale může pomoci rakovině se jim vyhnout (Topalian et al., 2015). Tyto proteiny zabraňují imunitním reakcím vazbou na receptory na povrchu imunitních buněk. Více kontrolních proteinů (jako je CD155 a PD-L1) cílí na receptor PD-1 na imunitních buňkách a jsou exprimovány v rakovině prsu, zejména TNBC (Li Y.-C. et al., 2020). Knockdown PD-L1 nebo jeho receptoru pomocí CRISPR/Cas9 může stimulovat imunitní systém k útoku na nádory TNBC (Yahata et al., 2019). Kromě toho bylo prokázáno, že downregulace exprese PD-L1 prostřednictvím delece CDK5 zprostředkované CRISPR/Cas9 inhibuje růst nádoru in vitro a in vivo (Deng et al., 2020). Inhibice růstu v in vitro a in vivo modelech rakoviny prsu naznačuje, že shRNA zprostředkovaná redukce CD155 může mít terapeutický účinek na rakovinu prsu (Gao et al., 2018).
CAR T buňky exprimují CAR, které rozpoznávají antigeny asociované s nádorem (TAA) a mohou využít knockdown kontrolních proteinů ke zvýšení své aktivity (Li C. et al., 2020). Existuje řada potenciálních cílů pro terapii CAR T buňkami u rakoviny prsu, včetně několika TAA, jako je HER2, mucin1 a TEM8 (Bajgain et al., 2018). Existují důkazy, že CAR T buňky cílící na mesothelin (nadměrně exprimovaný v buňkách TNBC BT-459) jsou účinnější proti rakovině, když je PD-1 vyřazen pomocí CRISPR/Cas9 (Hu et al., 2019). Izolace T buněk od pacientů a jejich následná editace ex vivo je však pracný a časově náročný proces. Ačkoli univerzální T buňky mohou snížit požadavky na izolaci, dárcovské T buňky exprimující lidský leukocytární antigen (HLA) třídy I a T buněčný receptor (TCR) by měly být odstraněny, aby se zabránilo abnormalitám reakce štěpu proti hostiteli (Ren et al., 2017). , 2017a). Pomocí CRISPR/Cas9 může HDR současně eliminovat TCR a HLA a vyřadit gen kódující CAR. Studie ukázaly, že CRISPR/Cas9 lze použít k zavedení anti-CD19 CAR do lokusu TCR, čímž se efektivně produkují CAR bez deplece T buněk (Dimitri et al., 2022). Byly vyvinuty multiplexní technologie pro generování alogenních CAR T buněk současnou eliminací TCR, beta-2-mikroglobulinu (B2M), podjednotky HLA-I a dalších proteinů, jako je PD-1 a CTLA-4, které mohou mít větší protirakovinné vlastnosti proti TNBC (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022).
Použití CRISPR/Cas9 by mohlo zlepšit účinnost CAR-T buněk. Je známo, že adenosin má imunosupresivní vlastnosti a může snižovat protirakovinnou imunitu blokováním funkce T buněk a aktivací adenosinu A2A receptorů (A2AR) (Vigano et al., 2019). Umlčení A2AR pomocí CRISPR/Cas9 významně zlepšilo účinnost CAR-T buněk in vivo (Giuffrida et al., 2021). Je známo, že T buňky vykazují různé fenotypové charakteristiky, jako je buněčná expanze, diferenciace, oxidační stres a genomový stres. Screening T buněk založený na CRISPR/Cas9 odhalil narušení 25 různých kináz receptorů T buněk. Mezi nimi bylo prokázáno, že delece kinázy p38 zvyšuje protinádorovou aktivitu T buněk, což naznačuje, že kináza p38 je klíčovým regulátorem regulace CAR-T buněk (Gurusamy et al., 2020).
T buňky lze geneticky modifikovat pomocí CRISPR/Cas9 za účelem produkce vysoce exprimovaných TCR. Přenos geneticky modifikovaných T buněk pacientům prokázal silnější protinádorovou aktivitu než endogenní T buňky. Endogenní TCR proto mohou u pacientů konkurovat geneticky modifikovaným TCR, což může ovlivnit potenciál imunoterapie rakoviny. Aby se tento problém překonal, může použití CRISPR/Cas9 k odstranění endogenního TCR-β v buňkách příjemce a následný přenos TCR-β T buněk pacientům s rakovinou vykazovat lepší protinádorové imunitní odpovědi bez nutnosti sexuální kompetice endogenního TCR (Fan et al. 2018). S výjimkou T buněk modifikovaných CRISPR jsou tedy TCR tisíckrát citlivější na nádorové antigeny než normální T buňky transdukované TCR. Navíc u různých leukémií vykazují modifikované T buňky generované pomocí γδ TCR+ CRISPR vyšší expresi CD4+ a CD8+ T buněk než standardní přenos TCR (Legut et al., 2018). Modifikované T buňky generované metodou CRISPR/Cas9 tak mohou být účinnou metodou imunoterapie k překonání TNBC.
Integriny jsou molekuly buněčné adheze, které jsou přítomny v buněčných transmembránách a podporují vazbu buněk na extracelulární matrix (ECM) (Hamidi a Ivaska, 2018). Dysregulace integrinů je spojena s rozvojem a migrací rakoviny změnou extracelulární matrix, což vede k přežití rakovinných buněk v oběhu (Hamidi a Ivaska, 2018). Snížení hladiny integrinu zprostředkované CRISPR/Cas9 zpomaluje progresi nádoru, metastázování a kolonizaci u TNBC. Bylo hlášeno, že snížení hladiny integrinu a5 (ITGA5) snižuje migraci a progresi buněk u jiných druhů rakoviny, jako je rakovina plic (Ju a kol., 2017), což naznačuje, že integrin a5 může být také klíčovým faktorem v patogenezi TNBC.
Generování knockout myší pomocí tradičních metod embryonálních kmenových (ES) buněk je pracný, časově náročný a neefektivní proces. Trvá měsíce a roky, než se ES buňky zaměří homologní rekombinací, šlechtí chimérické myši a poté je zkříží s heterozygotními myšmi za účelem produkce homozygotních potomků. Pro vytvoření myší s více genetickými mutacemi je nutné komplexní křížení. Při použití myší generovaných ablací ES buněk pomocí CRISPR/Cas9 nebo mikroinjekcí složek CRISPR/Cas9 do oplodněných vajíček z jednotlivých buněk však vzniklo mnoho problémů. Například k zavedení změn často dochází v bialelických lokusech a není to genově specifické. Nedávno bylo popsáno, že ES buňky využívající technologii CRISPR/Cas9 mohou současně vkládat bialelické mutace až do 5 genů (Nishizono et al., 2021). Za tímto účelem byla do ES buněk současně transfekována mRNA Cas9 a pět genově specifických gRNA. To zdůrazňuje slibnost a účinnost tohoto postupu, ačkoli tyto mutace mohly být přeneseny, když byly zakladatelské linie šlechtěny za účelem produkce pětinásobně knockoutovaných myší. Studie také uvádí překvapivý objev: ES buňky již nejsou potřeba k vytvoření geneticky modifikovaných myší. Místo toho byly za účelem odstranění specifických genových produktů injikovány Cas9 mRNA a gRNA do embryí v jednobuněčném stádiu. V důsledku toho byly vytvořeny knockout zakladatelské linie, které lze teoreticky použít ke studiu důsledků delece genů u myší (Qin et al., 2016). CRISPR/Cas9 tak umožňuje vytvoření transgenních myší k léčbě TNBC s nižšími náklady než tradiční genetické inženýrství. Pomocí systému CRISPR/Cas byl vyvinut nový model knockout myši, který dokáže úspěšně zavést bodové mutace v jednom nebo více endogenních genech v TNBC. Na základě tohoto konceptu lze také vyvíjet zvířecí modely TNBC s použitím CRISPR/Cas9-zprostředkované delece BRCA1 a p53, což vede ke ztrátě opravy HR, genomové nestabilitě a mutantním fenotypům (Annunziato et al., 2020).
V současné době se k diagnostice TNBC používají různé metody, jako je mamografie, magnetická rezonance (MRI) a ultrazvuk. Tyto metody však mají určitá omezení. Mamografie se používá k diagnostice lokální tkáně prsu, nikoli metastáz, kde rakovinné buňky migrovaly do jiných orgánů. Ultrasonografie není spolehlivou metodou pro diagnostiku TNBC (Chen a Lee-Felker, 2023). MRI má vyšší citlivost než ultrazvuk a mamografie, ale její diagnostická přesnost je omezená (Sha a Chen, 2022). Biopsie tkáně je invazivní způsob identifikace rakovinných buněk. V některých případech však biopsie může rakovinnou tkáň minout, pokud se jehla odchýlí od oblasti zájmu. Kromě toho je velmi drahá a pro pacientku může být traumatická. TNBC je heterogenní typ rakoviny, takže biopsie nemusí poskytnout dostatek informací o typu rakoviny. Proto je naléhavě potřeba nová diagnosticky spolehlivá metoda pro detekci TNBC. CRISPR/Cas9 může sloužit jako vysoce citlivá a minimálně invazivní alternativa pro diagnostiku rakoviny prsu. Za tímto účelem lze strategie založené na CRISPR/Cas9 využít ke zlepšení metod PCR pro diagnostiku TNBC. Nejprve se proteiny Cas9 a cpf1 systému CRISPR použijí k odstranění nespecifické DNA a poté tyto dva proteiny (Cas9 a cpf1) dokáží rozpoznat sekvenci PAM před vazbou na cílovou DNA (Deepak Singh a kol., 2021). PCR tak může identifikovat mutace spojené s rozvojem rakoviny. Několik studií přijalo tuto strategii založenou na CRISPR k detekci různých mutací u různých druhů rakoviny (Safari a kol., 2019). Metody PCR založené na CRISPR tak mohou snížit závislost diagnostiky TNBC na invazivních metodách, jako je imunohistochemie založená na biopsii.
Genotypové změny v regulaci hormonálních receptorů byly prokázány také u TNBC (Chen a Russo, 2009). Strategie PCR založené na CRISPR/Cas9 využívající mikročipy pro diagnostiku v místě péče mohou tyto mutace účinně monitorovat (Hajian et al., 2019). Mohly by také poskytnout poskytovatelům zdravotní péče relevantní informace o specifických mutacích u pacientů s TNBC, což by mohlo pomoci zlepšit jejich léčebný průběh. Tato kombinovaná technika má však svá omezení. Proto je zapotřebí rozsáhlého výzkumného úsilí, než bude možné tuto metodu CRISPR/Cas-PCR použít ve zdravotnictví pro diagnostiku TNBC (Yang et al., 2019).